张清清，冯 媛，蒋林林，孔亚丽，李春花

（1.河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200；2.河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050091；3.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110）

栀子柏皮汤作为清泄湿热、治疗黄疸的经典方剂之一，最早记载于医圣张仲景的《伤寒论》中，其原文写到“伤寒，身黄，发热，栀子柏皮汤主之”[1]。原方由栀子、黄柏、炙甘草组成，且现代药理学研究已证明栀子柏皮汤具有较好的保肝利胆作用。随着当代中医药事业的发展，栀子柏皮汤作为经典方剂也常被人们作为研究的对象，主要从其化学成分[2-6]、煎煮方法[7-8]、提取工艺对药效的影响[9-11]，原方与拆方对药效的影响[12]，现代临床药理作用等方面研究[13-17]。栀子柏皮汤所含化学成分复杂多样，其主要有效成分有环烯醚萜苷类、生物碱类、三萜皂苷类、黄酮类等，因此要建立复方的科学合理的质量评价体系仍然存在困难和挑战。

中药方剂配伍科学性的研究对中医药现代化、进一步发扬方剂的整体优势及开发高效方剂具有重要意义。栀子柏皮汤由栀子、黄柏、炙甘草组成，其中甘草具有调和诸药、缓和药性的作用，那么栀子柏皮汤中的炙甘草药味的加减对指标成分的含量会产生怎样的影响？本课题选用栀子柏皮汤为研究对象，采用高效液相色谱法，通过对全方及缺炙甘草拆方中指标性成分进行含量测定和比较，以阐释炙甘草药味的有无对复方所含指标成分的影响趋势，进而为栀子柏皮汤的质量控制和炙甘草调和药性作用研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 试药3个不同批次的栀子、黄柏、炙甘草饮片，均购自国药乐仁堂河北药业有限公司，具体信息见表1。经河北中医学院张丹副教授鉴定分别为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）、芸香科植物黄皮树（Phellodendri Chinensis Schneid.）、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的正品。（成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；磷酸（分析纯，天津光复科技发展有限公司）；超纯水自制。

表1 供试品分组信息（n=3）

1.2 试剂 栀子苷对照品（批号：MUST-17110105）、甘草酸对照品（批号：MUST-17060805）、盐酸小檗碱对照品（批号：MUST-17110105）、盐酸巴马汀对照品（批号：MUST-18022604）

1.3 主要仪器Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪，配置1260紫外检测器（美国Agilent公司）；TD5A-WS离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；98-1-B型电热套（天津泰斯特仪器有限公司）；EQ-100DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius分析天平（0.01 mg，赛多利斯科学仪器有限公司）；Sartorius分析天平（0.1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司）；RE-52旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Millipore Bedford纯水仪（美国millipore公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Dikma Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm,5μm）色谱柱；流动相系统：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱，0～20 min 10%～30%A；20～40 min 30%～40%A；40～50 min 40%～60%A；50～55 min 60%～90%A；55～57 min 90%～10%A）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：238 nm（栀子苷、甘草酸）、265 nm（盐酸小檗碱、盐酸巴马汀）；进样量：10μL。理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于4 400。

2.2 样品的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品3.9 mg、甘草酸对照品4.9 mg、盐酸小檗碱对照品1.2 mg、盐酸巴马汀对照品1.0 mg，分别置于5 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶解，定容，得各对照品母液。用移液枪精密吸取各对照品母液适量分别加至5 mL容量瓶中，70%甲醇定容，分别得栀子苷（104μg/mL）、甘草酸（131μg/mL）、盐酸小檗碱（32μg/mL）和盐酸巴马汀（27μg/mL）对照品溶液，进样前过0.22μm微孔滤膜。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密吸取栀子苷对照品母液400μL、甘草酸对照品母液25μL、盐酸巴马汀母液2μL、盐酸小檗碱母液1 mL，加入到同一5 mL棕色容量瓶中，以70%甲醇定容至刻度线，混匀，即得含栀子苷（62.40μg/mL）、甘草酸（24.50μg/mL）、盐酸小檗碱（48.00μg/mL）和盐酸巴马汀（0.08μg/mL）的混合对照品溶液，进样前过0.22μm微孔滤膜。

2.2.3 栀子柏皮汤全方水煎液供试品的制备 称取栀子10 g、黄柏6 g、炙甘草3 g置同一个500 mL的圆底烧瓶内，平行处理3份，加水190 mL，浸泡1 h，然后煎煮1 h，过滤，第2、3次加水量均为150 mL，每次煎煮30 min，过滤，合并3次滤液。将所得的滤液浓缩至60 mL。精密吸取0.25 mL于25 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶液定容至刻度，进样前过0.22μm微孔滤膜，即得栀子柏皮汤全方供试品溶液，备用。

2.2.4 拆方组水煎液供试品的制备 称取栀子10 g、黄柏6 g，按照上述同样的制备方法制备缺炙苷草拆方组（拆方组）样品，平行处理3份。

2.2.5 炙甘草组水煎液供试品的制备 称取炙甘草3 g，按照上述同样的制备方法制备炙甘草组样品，平行处理3份。

为保证实验的平行性和可比性，拆方组、炙甘草组的加水量、煎煮时间、浓缩后的体积均与全方组相同，最终制得拆方组供试品溶液和炙甘草组供试品溶液，备用。具体分组信息见表1。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取上述混合对照品溶液、全方组供试品溶液、拆方组供试品溶液及炙甘草组供试品溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，结果显示全方组供试品中栀子苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、甘草酸与相邻色谱峰分离良好，且与对照品保留时间一致，拆方组供试品溶液无甘草酸色谱峰，炙甘草组供试品溶液无栀子苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀色谱峰，表明专属性较强。（见图1～4）

图1 238 nm波长下HPLC色谱图

图2 全方组238 nm波长下HPLC色谱图与局部放大图

图3 265 nm波长下HPLC色谱图

图4 全方组265 nm波长下HPLC色谱图与局部放大图

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按照上述色谱条件分别进样1、2、4、10、20、50μL，记录各成分在对应波长下的色谱峰面积。分别以栀子苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、甘草酸的质量（μg）为横坐标（X），其色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并进行线性回归。（见表2）

表2 回归方程与线性范围

2.3.3 精密度试验 取同一混合对照品溶液适量，按上述色谱条件重复进样6次，记录各成分在对应波长下的峰面积和保留时间。计算栀子苷、甘草酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为0.86%、0.29%、0.90%、2.95%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下制备的同一全方组供试品溶液，按上述色谱条件分别在制备后0、2、4、8、12、18、24 h进样，测定并记录各成分峰面积。计算栀子苷、甘草酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为2.40%、2.82%、2.31%、1.18%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 分别取同一组复方中的单味药材，按照“2.2.3”项下方法制备全方组供试品溶液，平行处理6份，按照上述色谱条件，测定峰面积并计算含量，结果栀子苷、甘草酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量的RSD分别为0.90%、1.56%、2.08%、3.00%，表明方法的重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 称取同一组已知含量的栀子5 g、黄柏3 g、炙甘草1.5 g，平行6份，分别加入与每份含量相同的各对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。并按上述色谱条件，进样10μL。记录峰面积，计算栀子苷、甘草酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的平均加样回收率和RSD，具体结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

续表3：

2.4 样品含量测定 按照表1的分组，分别称取3个批次的各单味药材，按照“2.2.3”项下的供试品溶液制备方法，每组平行处理3份，按上述色谱条件进行含量测定，根据标准曲线计算各成分含量，由结果分析可知，栀子苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀在全方组水煎液中的溶出率均低于拆方组，且甘草酸在全方组水煎液中的溶出率低于炙甘草组，在一定程度上反映出，炙甘草药味的存在削弱了复方中栀子苷成分和生物碱类成分盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的溶出。（见表4）

表4 不同组别水煎液中指标成分在对应单味药材中的含量（±s，n=3）

表4 不同组别水煎液中指标成分在对应单味药材中的含量（±s，n=3）

组别 栀子苷 盐酸小檗碱 盐酸巴马汀 甘草酸各组成分含量(mg/g)全方组1 46.44±0.23 24.10±0.43 0.29±0.05 14.52±0.59全方组2 47.47±1.05 23.36±0.71 0.25±0.01 12.97±0.65全方组3 48.68±0.78 22.50±0.52 0.30±0.02 14.09±0.19拆方组1 52.39±0.85 27.35±1.38 0.39±0.01 /拆方组2 50.77±0.54 25.80±0.89 0.36±0.03 /拆方组3 52.02±1.52 26.13±0.26 0.38±0.01 /炙甘草组1 / / / 23.15±0.45炙甘草组2 / / / 21.58±0.80炙甘草组3 / / / 22.53±1.01平均含量(mg/g) 全方组 47.53±1.12 23.32±0.80 0.28±0.03 13.86±0.80拆方组 51.73±0.85 26.43±0.82 0.38±0.02 /炙甘草组 / / / 22.42±0.79

3 讨 论

本实验构建的基于HPLC-DAD技术的含量测定方法可成功用于栀子柏皮汤及其拆方中各目标成分的定量分析。通过比较全方组和拆方组的成分含量，可知全方中炙甘草药味的加入均降低了栀子苷和生物碱类成分盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的含量。根据前期文献报道，栀子苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、甘草酸等成分是栀子柏皮汤发挥保肝利胆作用的重要物质基础。其中栀子苷是栀子发挥保肝利胆作用的药效物质，但同时有研究报道栀子苷具有一定的肝脏毒性；而生物碱类成分在发挥保肝利胆作用的同时具有苦寒之性[18]，甘草的加入缓和了栀子苷的肝毒性和生物碱的苦寒作用，这与甘草“调和诸药、缓和药性”之功相符。通过研究药味加减对组方中药效成分含量的影响，有助于阐明栀子柏皮汤的配伍科学性，除拆方组外，其他拆方组和各单味药材组的差异分析将在后续论文中报道。本方法简便、准确、稳定，为栀子柏皮汤的质量控制和配伍科学性研究了提供参考。