卢 月，亓 篧，陈曲波，韩 凌,3，郜恒骏，卢传坚,3

（1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510006；2.生物芯片上海国家工程研究中心，上海 201203；3.广东省中医证候临床研究重点实验室，广东 广州 510006）

银屑病是一种慢性迁延、易反复发作的皮肤炎症性疾病。世界卫生组织（WHO）2016年报告全球银屑病患病率在0.09%到11.43%之间[1]，我国发病率近25年间由0.12%增长至1.49%，银屑病已成为危害公共健康的常见疾病[2]。银屑病在治疗上存在诸多缺陷，往往缓解期短，易复发，易耐受，且大多数药物都存在相当的毒副作用。中医学在治疗银屑病方面具有独特的理论体系，长期以来积累了丰富的临床经验。中医证候是中医学临床与基础的核心，是中医药现代化研究中的重要内容。课题组对1979—2010年寻常型银屑病文献证候分布情况进行分析，发现寻常型银屑病患者所有证型中，排前3位的证候血热证（32.86%）、血燥证（23.56%）、血瘀证（19.43%），累计共占75.85%；并且血瘀证与稳定期相关，消退期与血燥证相关[3-4]。

本课题通过基因表达谱芯片和miRNA芯片技术，对银屑病三种常见中医辨证分型患者的外周血单核细胞基因表达水平和miRNA表达水平进行分析，对差异表达基因和miRNA进行关联分析，从基因和miRNA水平揭示银屑病不同证型的微观物质基础。

1 资料与方法

1.1 纳入标准 符合寻常型银屑病诊断标准[5]，中医证型诊断符合白疪证型诊断[6]；签署知情同意书。

1.2 排除标准 妊娠或哺乳期妇女；近半年内服用过类固醇药物和/或服过维甲酸类药物或用过生物制剂；1个月内外用过类固醇制剂或维甲酸类乳膏；合并有甲状腺功能亢进、心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等原发性疾病和精神病患者，以及长期服药的患者；多种中医证型夹杂的患者。

1.3 研究对象 所有患者均来源于广东省中医院皮肤科门诊和病房。经本院伦理委员会批准。寻常型银屑病组：共62例，其中血热证16例，血瘀证23例，血燥证23例；男44例，女18例；平均年龄45.5岁（19～60岁），病程1个月至10年。健康对照组：共10名，均为门诊体检健康者，性别和年龄与银屑病组相匹配。

1.4 仪器及试剂TRI Reagent（德国Sigma公司，货号：T9424），miRNeasy Micro试剂盒（德国QIAGEN公司，货号：217084），RNase-Free DNase Set（德国QIAGEN公司，货号：79254），Affymetrix表达谱配套试剂盒GeneChipRWT PLUS试剂盒（美国Affymetrix公司，货号：902280)，GeneChipR杂交洗脱染色试剂盒（美国Affymetrix公司，货号：900720），滚动杂交炉（美国Affymetrix公司，货号：00-0331-220V），洗涤工作站450DX2（美国Affymetrix公司，货号：00-0335），数据采集软件Command Console Software 3.1（美国Affymetrix公司），数据分析软件Transcriptome Analysis console Software（美国Affymetrix公司）；Agilent Bioanalyzer 2100电泳仪（美国Agilent公司）；芯片扫描仪GeneChipRScanner 3000DX2（美国Affymetrix公司，货号00-0334）；本实验选用芯片为Affymertix公司的GeneChipRclariom D基因芯片和Agilent Human miRNA，Release 21.0（8*60K,Design ID：070156）芯片。

1.5 标本采集及处理 采集肘静脉血10 mL于含有肝素的抗凝管中，按照试剂盒说明书分离外周血单核细胞（PBMC），置-80℃冰箱保存。

1.6 RNA的抽提与质检 根据Sigma提供的标准操作流程,采用TRI Reagent对样本总RNA进行抽提，进而使用miRNeasy Micro试剂盒和RNase-Free DNase Set纯化总RNA。在质检评断合格后，纯化后的总RNA，经Agilent Bioanalyzer 2100电泳仪评估RNA的完整性。

1.7 基因芯片实验 本研究采用Affymetrix表达谱配套试剂盒GeneChipRWT PLUS试剂盒，按照生产厂商规定的标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行体外反转录扩增，同时用生物素（biotin）标记cRNA。

按照Affymetrix芯片杂交流程，把生物素标记的cRNA加入盒式芯片中，按照表达谱芯片配套提供的杂交标准流程使用配套试剂盒，在45℃滚动杂交炉中滚动杂交16 h，杂交完成后在洗涤工作站按照标准操作流程进行芯片的洗涤。

芯片结果采用芯片扫描仪GeneChipRScanner 3000DX2进行扫描，用Command Console Software 3.1软件读取原始数据，质控合格的数据采用Command Console Software 3.1软件进行归一化处理，使用Gene level_SST_RMA算法对数据进行质控并出具数据报告，采用Transcriptome Analysis console软件进行初步的基因差异表达分析。筛选P〈0.05，fold change≥2的差异基因，利用DAVID进行富集，选择P〈0.05的通路进行分析。

1.8 miRNA芯片实验 本研究使用的芯片为Agilent Human miRNA,Release 21.0（8*60K，Design ID：070156）芯片，样品总RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，参照芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。

采用Feature Extraction软件（version10.7.1.1,Agilent Technologies）处理原始图像提取原始数据。利用t检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P≤0.05。接着，利用3个数据库（Targetscan，microRNAorg，pita）共同对差异miRNA进行靶基因预测，接着对靶基因进行GO和KEGG富集分析，以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路。

根据表达谱芯片的差异基因分析结果，miRNA芯片差异miRNA及靶基因预测结果，利用DIANA在线工具及其数据库对基因芯片和miRNA芯片结果进行关联分析和维恩分析。

2 结 果

2.1 银屑病不同证型患者和健康人的表达谱芯片与miRNA芯片结果关联分析 我们根据银屑病不同中医证型患者和健康人miRNA芯片差异miRNA的靶基因预测结果，将表达谱分析的差异基因与miRNA芯片分析的差异miRNA按照差异改变负相关的关系进行关联分析。结果表明，银屑病血热证患者和健康人的差异miRNA包括hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；银屑病血燥证患者和健康人的差异miRNA包括hsa-miR-1-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；银屑病血瘀证患者vs健康人的差异miRNA包括hsa-let-7c-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-146a-5p等21个。（见表1～3）

表1 银屑病血热证患者和健康人差异miRNA与靶向差异基因

表2 银屑病血燥证患者和健康人差异miRNA与靶向差异基因

表3 银屑病血瘀证患者和健康人差异miRNA与相关联差异基因

2.2 三种银屑病中医证型与健康人关联分析差异miRNA筛选共有差异miRNA，将三种证型与健康人的差异基因和差异miRNA进行关联分析后，对各证型关联分析后miRNA和基因的差异倍数都≥1.2倍的miRNA进行韦恩分析，经分析得到共有差异miRNA为hsa-miR-485-3p。（见图1）

图1 三种银屑病中医证型患者与健康人关联分析差异miRNA

2.3 三种银屑病中医证型与健康人关联分析差异基因 筛选出的共有差异基因分析按照上述分析方法，将各证型关联分析后miRNA和基因的差异倍数都≥1.2倍的差异基因进行维恩分析。结果表明，三种证型的共有差异基因为miR-485-3p的靶基因RBMS1和FAM98B。（见图2）

图2 三种银屑病中医证型患者与健康人关联分析差异基因

2.4 三种银屑病中医证型存在靶标关系的特有差异miRNA和基因分析 关联分析和韦恩分析结果表明血瘀证存在靶标关系的特有差异miRNA和基因共142对，血燥证存在靶标关系的特有差异miRNA和基因共15对，而血热证不存在证型特有差异miRNA。

3 讨 论

银屑病疾病分期一般分为进行期、稳定期和消退期，与银屑病常见三种中医证型相对应。血热证多处于银屑病进行期，血热炽盛或外受毒热刺激，而致血热生风，风盛化燥，故皮损潮红脱屑，伴瘙痒，并口干、心烦、易怒，大便秘结，小便赤黄。血瘀证多处于稳定期，且病程长，湿毒内滞，气滞血瘀。此时皮损为暗红色，呈斑块状并肥厚，或呈苔藓样变，有明显浸润，伴瘙痒。血燥证多处于消退期，热毒蓄久，伤阴耗血所致。此时皮损颜色淡红，鳞屑少，伴瘙痒，并咽干、口干、大便秘结[7]。本课题通过基因表达谱芯片和miRNA芯片，在基因和miRNA表达水平对银屑病常见三种中医证型进行分析，并将结果进行关联，得到三种中医证型共有差异miRNA，以及可能是其作用靶点的差异基因。

经关联分析和韦恩分析，结果表明血瘀证组存在靶标关系的特有差异miRNA和基因共159对，血燥证组存在靶标关系的特有差异miRNA和基因共16对，而血热证组不存在证型特有差异miRNA。SLA2与其调控的hsa-miR-26b-5p是血瘀证组存在靶标关系的特有差异miRNA和基因之一。SLA2（Src like adaptor 2，又名SLAP-2）是主要在造血细胞中表达的衔接蛋白。在T细胞中，SLAP-2与几种酪氨酸磷酸化蛋白相结合，通过与泛素连接酶c-Cbl的相互作用负性调节T细胞抗原受体下游信号传导[8]。此外，hsa-miR-26b-5p与代谢调节、糖尿病相关[9]。WASL与hsa-miR-1-3p是血燥证组存在靶标关系的特有差异miRNA和基因。WASL（WASP like actin nucleation promoting factor，又名N-WASP）在细胞迁移、免疫炎症反应中发挥重要作用，该基因可以通过调控NF-kB和MAPK信号通路进而影响牙龈成纤维细胞中炎症细胞因子的表达[10]。并且，WASL可以调控IL-23在角质形成细胞中的表达，进而影响慢性皮肤炎症的发生[11]。hsa-miR-1-3p与其靶基因作用，参与系统性红斑狼疮等免疫性疾病的发生[12]。

经分析得到三种中医证型共有差异miRNA为hsa-miR-485-3p。研究表明，miR-485-3p通过下调Top2α的表达，调控核因子-YB影响DNA拓扑异构酶Ⅱα的表达和药物反应性[13]。此外，miR-485-3p是盘状皮肤红斑狼疮发病机制中的调控因子，通过调节炎症介质的产生，从而促进盘状皮肤红斑狼疮病变中的皮肤炎症，说明miR-485-3p与皮肤免疫炎症密切相关[14]。RBMS1（RNA Binding Motif single stranded interacting protein 1）是结合单链DNA/RNA的小蛋白家族成员，参与DNA复制与细胞周期调控。RBMS1能够特异性结合C-myc基因上游的复制起始区[15]，调控C-myc表达，调控银屑病表皮角质形成细胞的增殖与分化。此外，RBSM1可通过IL-6/STAT3信号通路促进胃癌细胞的侵袭转移[16]。研究[17]表明，与健康人比较，血热证银屑病患者皮损中JAKl/STAT3信号通路活化程度显着升高，下游因子C-myc、VEGF表达量升高，同时高于血燥证和血瘀证患者，证型间的表达水平呈血热证〉血瘀证〉血燥证的状态。RBSM1是否通过JAKl/STAT3调控下游因子C-myc、VEGF的表达发挥影响三种证型状态的机制还需要进一步深入研究。研究表明，中国汉族人群RBMS1基因rs7593730位点与代谢性疾病2型糖尿病具有显着相关性，RBMS1和ITGB6基因2q24位点的突变人群具有2型糖尿病易感性[9]。研究[18]显示，FAM98B与hCLE、DDX1、HSPC117形成复合物，在细胞核和细胞质之间穿梭以转运RNA，在控制细胞核和细胞质RNA功能中发挥重要作用。FAM98B作为银屑病三种证型中共有差异靶基因，其在银屑病方面的作用还尚未报道。

本研究通过对寻常型银屑病不同中医证型患者外周血单核细胞的基因表达谱芯片与miRNA芯片结果进行关联分析，得到银屑病不同中医证型的微观物质基础；并且发现miR-485-3p及其靶基因RBMS1和FAM98B有可能是参与银屑病发生的重要miRNA和基因。