何美君，贾 博，白 光

（1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110847；2.北京中医药大学附属东直门医院，北京 100700；3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110033）

随着当代社会的飞速发展，人们面对的各方面生活压力随之增加，近年来胃食管反流疾病（gastroesophageal reflux disease，GERD）和抑郁症（depressive disorder）的发病率均有逐年增高的趋势，且两种疾病经常相伴产生并互相影响[1]。GERD是指胃内容物反流入食管造成黏膜损伤的疾病，伴有反酸、嗳气、咽喉异物感等症状，且常有患者发生焦虑、抑郁等精神心理异常[2]。抑郁症是一种情绪障碍性疾病，以心情低落为主症常伴随一些胃肠功能紊乱的症状[3]。这两种疾病都具有病程久、费用高、易复发的特点。有研究指出，伴有抑郁的人群患GERD的风险是健康人的1.7倍[4]。抑郁状态可导致患者出现反酸、腹胀等一系列胃肠道神经调节功能异常的表现，这些胃肠道症状又可以反过来加重患者的焦虑、抑郁情绪。如此恶性循环严重影响患者的健康。

半夏厚朴汤源自张仲景的《金匮要略》，是被历代医家常用的经典方剂，具有疏肝、养血、健脾等功效。半夏厚朴汤在临床中应用广泛，其在治疗GERD、抑郁症中疗效显着[5-6]。“异病同治”是指发病机制相同的不同疾病可以运用同种治法。GERD和抑郁症虽病名不同，疾病过程不同，但发病机制均与肝气郁结密切相关。因此可以根据“异病同治”的原则，用半夏厚朴汤从肝论治此二病，施以疏肝理气之法以奏调气和血，解郁降逆之功。然而，半夏厚朴汤能够发挥作用的具体细胞分子作用机制仍不明确。本研究拟运用网络药理学和分子对接的方法，构建“药物-靶点-疾病”之间相互作用关系，从多角度探索中药方剂的有效成分与机体生命活动的互作规律。深入探究半夏厚朴汤“异病同治”GERD和抑郁症的分子机制，为新药研发和扩展临床应用提供依据。

1 方 法

1.1 获取半夏厚朴汤有效成分及靶点 运用中药系统药理数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）检索半夏厚朴汤中半夏、厚朴、茯苓、生姜、紫苏5味中药的所有化学成分。筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性指数（drug-like，DL）≥0.18的化合物及其作用靶点。

1.2 获取半夏厚朴汤与胃食管反流病和抑郁症的共有靶点 通过GeneCards数据库搜集GERD、抑郁症的疾病靶点。对药物靶点与疾病靶点取交集，得到半夏厚朴汤与GERD和抑郁症的共有靶点。

1.3 网络构建 以“1.1”和“1.2”得到的化合物、靶点、疾病名作为节点，导入Cytoscape3.6.0构建“半夏厚朴汤-共有靶点-疾病（GERD/抑郁症）”相互作用网络模型。

1.4 蛋白质相互作用网络 将“1.2”得到的半夏厚朴汤治疗GERD和抑郁症的共有靶点输入至String网站构建并绘制蛋白质相互作用关系图（PPI），设置confidence score值为0.900，将PPI网络以TSV格式导入Cytoscape3.6.0进行可视化处理。

1.5 生物学功能及通路富集分析 用R3.6.1对共有基因进行基因本体分析（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.6 筛选通路的关键靶标 将关键通路靶点分别导入String 11.0数据库。用Cytoscape3.6.0软件进行Network Analysis网络拓扑分析，根据度值（Degree）筛选出关键靶标。

1.7成分-靶点分子对接 将“1.6”中分析得到的核心靶点与其对应的活性成分进行分子对接。在PubChem数据库获取化合物2D结构并保存成SDF格式文件。用ChemOffice软件修饰化合物的SDF格式文件，使自由能最小并保存成mol2的格式。在PDB数据库检索核心靶点并保存为pdb格式，运用PyMOL软件对受体进行去除水、小分子配体的操作，再用AutoDock－Tools软件为受体加氢，然后将配体和受体都转化成pdbq的文件格式保存。最后运用Auto Dock Vina对成分与靶点之间的结合活性进行评价，并用PyMOL软件可视化。

2 结 果

2.1 半夏厚朴汤中有效成分筛选及靶点的获取 将半夏厚朴汤中半夏、厚朴、茯苓、生姜、紫苏5味中药上传至TCMSP数据库，按照OB≥30%且DL≥0.18的标准筛选，半夏厚朴汤中含有49个活性化合物，去重后共获得124个药物作用靶点。（见表1）

表1 半夏厚朴汤相关化学成分

2.2 半夏厚朴汤治疗GERD和抑郁症的共有靶点获取 通过GeneCards数据库搜集GERD、抑郁症相关靶点，获得GERD靶点2 960个，抑郁症10 105个。疾病靶点与半夏厚朴汤的124个作用靶点取交集，最后得到共有靶点有76个，并绘制Venn图。（见图1、表2）

表2 半夏厚朴汤与胃食管反流病、抑郁症的交集靶点

图1 半夏厚朴汤与胃食管反流病、抑郁症靶点交集图

2.3 半夏厚朴汤治疗GERD及抑郁症网络图 将“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶点导入Cytoscape 3.6.0后，构建“半夏厚朴汤-中药-有效成分-‘GERD、抑郁症’共有及各有靶点”网络图。（见图2）

图2 半夏厚朴汤-有效成分-疾病靶点网络图

2.4 对共有靶点进行分析 将76个共有靶点导入STRING11.0数据库，构建共有靶点间的蛋白质相互作用关系网。以TSV格式导入Cytoscape，用“Network Analysis”功能计算各靶点度值（Degree），得到平均值为5.67。其中排在前3名的是蛋白分别是AKT1（Degree=20）、MAPK1（Degree=18）、JUN（Degree=17）。（见图3）

图3 蛋白质-蛋白质间相互作用网络图

2.5 半夏厚朴汤与GERD和抑郁症交集基因GO功能富集和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析GO富集分析结果显示，分子功能（molecular function，MF）19个，生物过程（biological process，BP）1个。主要包括G蛋白偶联受体活性、神经递质受体活性、类固醇激素受体活性、激活转录因子结合、乙酰胆碱受体活性等。（见图4）

图4 交集靶点GO富集结果气泡图

2.5.2 KEGG分析 进行KEGG信号通路富集分析获得P<0.01的信号通路20条，说明半夏厚朴汤可能作用于PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信号通路中的某些因子从而发挥“异病同治”GERD和抑郁症的作用。（见图5）

图5 交集靶点通路富集结果图

2.5.3 关键通路中蛋白质的相互作用网络的构建并筛选关键靶点 为了深入探索重要通路中各作用靶点的互作关系，将PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1这4条信号通路的靶点分别导入String11.0数据库，并用Cytoscape3.6.0软件使结果可视化。节点为蛋白，节点越大、颜色越鲜艳，则蛋白度值（Degree）越高。边为蛋白间作用关系，线段越粗、颜色越鲜艳则其combine score值越高，作用关系更紧密。保留上述4条通路的网络分析结果，根据度值对靶点进行排序。结果显示，满足度值≥中值，且在通路中出现次数≥3次的靶点共有3个，分别是丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）。（见图6）

图6 重要通路的蛋白相互作用网络

2.6 核心靶点蛋白受体与其对应化合物的分子对接结果 将“2.5.3”中筛选得到的核心靶点MAPK1、AKT1、IL-6分别与其对应的主要活性成分（包括木犀草素、β-胡罗卜素、黄芩素）进行分子对接。且这3个化合物在网络中的度值排在所有化合物的前5名，这表明它们可能作为药物的关键活性成分在网络中起重要作用。结合自由能是评价配体与受体的结合稳定性的标准。活性化合物和靶点蛋白受体间的结合活性度越高，则两者结合能越低，当结合能≤5.0 kcal/mol，则认为分子与靶点有较好的结合活性，结合能≤-7.0 kcal/mol，表示有强烈的结合活性[7]。分子对接结果显示，MAPK1、AKT1、IL-6与对应化合物对接结合能均<-7.0 kcal/mol，这提示活性成分可以对核心靶点发挥调控作用，为后续进一步实验验证奠定了基础。（见表4、图7）

表4 重要靶点与其对应化合物的结合能

图7 分子对接展示图

3 讨 论

“异病同治”治法是中医学辨证论治的精华，体现了中医认识疾病从整体出发的全局观。中医学认为GERD的总体病机为胃失和降，气机上逆，故临床常用疏肝和胃法来治疗GERD[8]。而抑郁症的病机多为肝气郁滞，气机不畅。熊霞军等[9]通过数据挖掘技术对抑郁症中医证候频数进行统计发现肝郁脾虚证为最常见的证型。情志不畅而肝气郁结，机体气机升降失调，或肝失疏泄而横犯脾胃，最后都会导致中焦脾胃升降失衡，影响脾胃运化功能。脾胃在病理状态下又会滋生痰浊等病理产物，进一步壅塞气机，如此形成恶性循环。这与现代医学的研究认为精神心理因素可通过脑-肠轴影响神经-内分泌-免疫网络的平衡，同时胃肠道的症状也可通过脑-肠轴影响大脑的情感中枢引发心理障碍的观点一致[10]。由此可见，治疗GERD和抑郁症的根本皆在于调和肝脾，即疏肝解郁，调达中焦脾胃气机。

本研究为进一步探究半夏厚朴汤“异病同治”GERD、抑郁症的作用机制，应用了网络药理学和分子对接的方法来分析其作用靶点和生物学功能。网络分析发现半夏厚朴汤治疗GERD和抑郁症主要通过PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信号通路，且通路中的MAPK1、AKT1、IL-6这3个蛋白在网络中起关键作用。

PI3K-AKT是细胞及个体生命活动中很重要的信号通路，是目前许多抗抑郁药物发挥作用的通路之一。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是具有营养神经细胞作用的一种蛋白质，对突触可塑性有重要影响，与抑郁症密切相关。研究表明，在大脑海马特定区，BDNF水平降低导致体内神经元分化减少，进而影响抑郁行为的发生[11]。PI3K-AKT通路激活后，通过调控下游BDNF等分子可调节突触可塑性产生抗抑郁效果[12]。Barrett食管是食管内黏膜屏障受损，柱状上皮取代了鳞状上皮所产生的病理变化，而GERD是其公认的重要危险因素。与正常食管和反流性食管炎相比，Barrett食管组织表皮生长因子受体（pidermal growth factor receptor，EGFR）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（erine-threonine protein kinase B，AKT）均明显上调[13]。这提示PI3K-AKT信号通路可能参与Barrett食管的发生，或能成为防治Barrett食管的有效手段。

IL-17信号通路可通过调节免疫炎症来影响GERD、抑郁症。有研究发现，在反流性食管炎大鼠食管组织中IL-17蛋白表达水平均明显高于正常对照组[14]。Th17细胞是CD4+T淋巴细胞亚群，能特异性地分泌IL-17。抑郁状态下小鼠脑内IL-17浸润增加，阻断Th17细胞形成可提高小鼠抗抑郁能力[15]。

细胞凋亡在GERD和抑郁症疾病进展中起到重要作用。有研究发现胃、十二指肠内容物反流入食管引起黏膜损伤后，TNF-α、Caspase-3、Survivin等凋亡相关基因、蛋白的异常表达引起黏膜上皮细胞凋亡，是导致食管黏膜上皮损伤的主要原因[16]。现有研究表明[17]，在抑郁症疾病中小鼠的海马里有明显的神经细胞凋亡发生，进而导致抑郁症的发生。

缺氧诱导因子（HIF）对于维持机体对缺氧的适应能力发挥了重要作用。HIF-1是一种异源二聚体，由α亚基和β亚基组成。HIF-1的调节亚基及活性亚基均为HIF-1α，因此它的生物活性由其α亚基实现。有动物实验研究发现，HIF-1α被激活时，BDNF和突触后密度蛋白95（postsynaptic density protein95，PSD95）的表达增加，最终促进海马神经元生长和突触可塑性的增加，从而发挥抗抑郁作用[18]。HIF-1α还参与反流性食道炎组织黏膜修复与损伤过程，并发挥重要作用[19]。有研究发现半夏厚朴汤可能通过下调PPARγ、HIF-1α的表达，来改善食道黏膜炎症状态下的缺氧微环境，起到治疗GERD的作用[20]。

综上所述，本研究运用网络药理学方法预测了半夏厚朴汤治疗GERD和抑郁症的多成分、多靶点、多途径的复杂网状关系，富集分析发现这些靶点在PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信号通路中发挥着重要作用，为更深层次探讨其作用机制提供了基础。这与目前研究的GERD与抑郁症在神经生物学方面有诸多相似机制一致。抑郁症可能会继发于GERD，反过来又增加患者对反流症状的敏感性，因此深入探究两病的共同病理机制具有必要性。本研究从微观角度解释了半夏厚朴汤可通过一些共同靶点异病同治GERD和抑郁症，为临床上合理应用和新药开发提供依据的同时，也丰富了“异病同治”的科学内涵。