多指标优选酒洗当归炮制工艺*

岳丽丹，赵永琪，张振凌，林秀敏，杜莉杰

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.中牟县中医院，河南 中牟 451450；3.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州 450046；4.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046）

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根[1]，其味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，主治血虚萎黄、经闭痛经、月经不调、崩中漏下等。《景岳全书·本草正》记载：“当归，其味甘而重，故专能补血；其气轻而辛，故又能行血。补中有功，行中有补，诚血中之气药，亦血中之圣药也。”[2]当归亦有“十方九归”“妇科圣药”之称。当归具有辛香气味，含挥发性成分α-蒎烯、柠檬烯等[3-4]，而且当归头和当归尾化学成分含量有所不同[3]。当归身偏于补血，当归头偏于止血，当归尾偏于活血，全当归偏于和血[5]。

2020年版《中华人民共和国药典》收载的当归炮制品为酒炙当归，而近百部的古文献对酒洗当归均有记载，《银海精微》[6]中首次收载了当归酒洗炮制，记载了“酒浸”“酒洗”，《汤液本草》[7]对酒洗炮制作用有了记载，写道“治外，酒洗”，《医学入门》[8]记载“血病酒蒸，治上酒浸，治外酒洗”。其他省、自治区、直辖市药品监督管理部门制定的炮制规范如《上海市中药饮片炮制规范》[9]记载：“酒洗当归：取当归，照酒炒法喷洒黄酒，拌匀，使之吸尽，晒干或低温干燥。每100 kg当归片，用黄酒15 kg”。各省、市炮制规范具体操作方法不同，目前对于酒洗当归主要为利用HPLC指纹图谱[10]的研究，以及不同浓度酒洗当归挥发性成分的研究[11]，未较系统地对酒洗当归炮制方法进行深层次的研究。本研究采用（L934）正交试验法对酒洗当归炮制工艺进行优选，以HPLC法测定酒洗当归中绿原酸、邻苯二甲酸、香草酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯8种成分含量作为质量标准，结合外观评价进行综合评分，并进行验证试验，旨在优选最佳酒洗当归炮制工艺，指导生产实践，并为后期的研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪（Waters公司，含Waters-2489检测器，Waters-1525泵）；XMT-DA型数显调节仪水浴锅（余姚市亚星仪器仪表有限公司）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SZ-93型自动双重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9070型数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BS210S型万分之一电子天平（北京SARTORIUS有限公司）；FW-200型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 材料 当归原药材购自甘肃岷县，经河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；黄酒（古越龙山绍兴花雕酒，陈年五年，酒精度：15.0%，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司酿造；古越龙山精制清醇三年，酒精度：10.0%，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司酿造；清爽型干黄酒，酒精度：12.0%，绍兴水乡黄酒酿造有限公司）；绿原酸对照品（批号：PS000627，质量分数＞98%）、香草酸对照品（批号：PS010559，质量分数＞98%）、洋川芎内酯I对照品（批号：PS011036，质量分数＞98%）、洋川芎内酯H对照品（批号：PS011038，质量分数＞98%）、阿魏酸松柏酯对照品（批号：PS011045，质量分数＞95%）、藁本内酯对照品（批号：PS010999，质量分数＞98%）均源自成都普思生物科技股份有限公司；邻苯二甲酸对照品（批号：Y14J9Y18890，质量分数＞98%，上海源叶生物科技有限公司）；阿魏酸对照品（批号：110773-201012，质量分数＞98%，中国食品药品鉴定研究院）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，双蒸水实验室自制。

2 方法与结果

2.1 酒洗当归饮片8种成分含量测定

2.1.1 色谱条件 WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.1磷酸（B），梯度洗脱条件为0～25 min，3%→18%A；25～30 min，18%→26%A；30～35 min，26%→31%A；35～50 min，31%→33%A；50～70 min，33%→37%A；70～90 min，37%→54%A；90～100min，54%→3%A；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。HPLC图见图1。

图1 混合对照品（A）与酒洗当归样品（B）的HPLC 图

2.1.2 供试品溶液制备 取酒洗当归粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、邻苯二甲酸、香草酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯对照品适量，分别置于5 mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到各对照品母液。分别吸取适量对照品母液置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到一定浓度的混合对照品母液，结果见表1。

表1 对照品溶液的配制

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.3”项下混合对照品母液稀释成一系列浓度，按照“2.1.1”项下色谱条件检测，以对照品溶液进样量（μg）为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。（见表2）

表2 8 种成分线性方程

2.1.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按照“2.1.1”项下条件连续进样6次，计算8种成分峰面积RSD值，RSD分别为1.59%、1.90%、2.11%、2.20、2.21%、2.42%、4.41%、4.60%，说明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，计算8种成分峰面积RSD值，RSD分别为1.14%、1.54%、2.86%、2.83%、2.93%、3.02%、3.09%、4.37%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一酒洗当归样品粉末6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件测定，计算8种成分含量的RSD值，RSD分别为1.24%、2.41%、2.80%、2.96%、3.16%、3.67%、4.09%、4.17%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精确称取已知含量的酒洗当归样品6份，每份0.20 g，分别精密加入8种成分对照品溶液适量，即对照品加入量与样品中成分含有量之比约为1∶1，按照“2.1.2”制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件测定，计算各成分加样回收率和RSD值，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

续表3：

2.2 单因素考察 从黄酒用量、黄酒酒精浓度、干燥温度分别考察，从外观性状和内在品质综合评价，确定各单因素对酒洗当归饮片的影响。

2.2.1 评价方法 由于2020年版《中华人民共和国药典》[1]未记载酒洗当归的外观性状评价方法，因此通过参考《上海市中药炮制规范》[12]酒洗当归以“质柔韧”和“香气浓郁，略具酒香气”为佳。以硬度和气味来进行评分，满分各10分，分别记为W1和W2，即外观性状评分W0=W1+W2[13]，具体外观性状与评分见表4。质量评价则照“2.1.2”项下制备供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定。为使试验结果能够全面反映酒洗当归的质量，本研究对外观性状分值与含量测定分值分别赋予一定的权重。由于硬度和气味等外观性状依靠个人感官判断，客观性不足，权重不宜过高，赋予外观性状评分权重为40%，质量评价评分权重为60%。综合评分H=W0/Wmax×40+绿原酸/绿原酸最大含量×5+阿魏酸/阿魏酸最大含量×25+洋川芎内酯I/洋川芎内酯I最大含量×5+洋川芎内酯H/洋川芎内酯H最大含量×5+香草酸/香草酸最大含量×5+阿魏酸松柏酯/阿魏酸松柏酯最大含量×5+邻苯二甲酸/邻苯二甲酸最大含量×5+藁本内酯/藁本内酯最大含量×5，满分为100分。其中，W0为酒洗当归的外观性状得分，Wmax为其外观性状得分最大值[14]。

表4 酒洗当归的外观评价表

2.2.2 黄酒用量单因素试验 取当归饮片3份，每份50 g，黄酒浓度为15%，用酒量5.0、7.5、10.0 g，40 ℃烘干，计算综合评分，结果见表5。

表5 黄酒用量考察结果

2.2.3 黄酒酒精浓度单因素试验 取当归饮片3份，每份50 g，黄酒浓度为10%、12%、15%，用酒量7.5 g，40 ℃烘干，计算综合评分，结果见表6。

表6 黄酒浓度考察结果

2.2.4 干燥温度单因素试验 取当归饮片3份，每份50 g，黄酒浓度为15%，用酒量7.5 g，干燥温度为40、50、60 ℃，计算综合评分，结果见表7。

表7 干燥温度考察结果

2.3 正交试验 通过查阅相关文献及单因素实验，最终选用正交表，以每份100 g当归的饮片，以酒精浓度、黄酒用量、干燥温度为考察因素，每个因素下取3个水平，以“2.2.1”项下的综合评分为评价指标，因素水平见表8。

表8 正交试验设计因素水平表

2.4 结果

2.4.1 正交试验结果 由表9数据可知，酒精浓度因素K2＞K1＞K3，用酒量因素K3＞K1＞K2，干燥温度因素K1＞K3＞K2。由方差分析表可知，酒精浓度、黄酒用量、干燥温度对酒洗当归质量有显着性响。结合直观分析数据，可得酒洗当归的最佳工艺是A2B3C1，即酒精浓度15%，黄酒用量20 g，干燥温度40 ℃。（见表9～10）

表9 正交实验结果表

表10 正交实验方差分析表

2.4.2 验证试验结果 取同一批次当归药材3份，每份100 g，采用酒洗当归工艺优化参数进行酒洗当归工艺再验证。按“2.1”项下含量测定方法进行多成分含量测定，并进行外观性状评分。结果见表11。

表11 工艺验证实验结果

3 讨论

当归具有良好的活血功效，与不同的药物配伍使用可用于各种血瘀证，现代药理实验研究表明[15-17]，当归含有挥发油、阿魏酸等多种有效成分，可保护心血管内膜细胞，降低血液黏度，抑制血小板聚集，增强血流动力，促进微循环并改善血液流变性，从而对心血管系统发挥良好的保护作用。中药经酒制后可增强其活血化瘀、通经活络及引药上行等作用[18]，“病在头面及手梢皮肤者，须用酒炒制借酒力以上腾之。咽之下脐之上须酒洗之。酒浸，助发之意也”[7]。当归经过酒洗后长于活血化瘀[19]，研究表明，当黄酒用量过少时，饮片太硬，而黄酒用量过多时，饮片则过疏散，并且难以吸收完全。干预实验结果表明，发现黄酒用量在10～20 g时，饮片性状较好。与单因素实验相比，在正交实验及其工艺验证实验当中适当扩大了样品用量，两者使用质量相同是为了平衡比较，但适当扩大样品用量有利于优选稳定性工艺，为以后酒洗当归饮片中试生产提供基础依据。

本研究以阿魏酸、藁本内酯等多种成分含量及外观性状评分为指标，考察酒精浓度、用酒量、干燥温度对酒洗当归质量的影响，优选酒洗当归炮制工艺参数。结果显示：当归饮片每100 g加15%的黄酒20 g，干燥温度为40 ℃时，有效成分含量较高，工艺稳定，外观性状良好。本研究建立了酒洗当归多成分含量测定的方法，可为以后酒洗当归的规范化生产提供参考和依据。