熊 瑛，吴愫青
（珠海市食品药品检验所，广东 珠海 519000）
海藻是常用的清热化痰药，其味苦、咸，性寒，归肝、胃、肾经，具有消痰、软坚散结、利水消肿的作用[1]。现代研究表明，海藻具有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4-5]、降血糖[6-7]、免疫调节[8-9]等作用，用于治疗单纯性甲状腺肿、乳腺增生、淋巴结核等疾病[10]。海藻在我国药用历史悠久，最早载于《神农本草经》，且历代本草均有收载。《中华人民共和国药典》[11]中海藻项下规定其基源为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum（Turn.）C.Ag.或羊栖菜Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.的干燥藻体。前者习称“大叶海藻”，后者习称“小叶海藻”。海藻生长在低潮线以下浅海水激荡处的岩石上。大叶海藻（海蒿子）主产于山东、辽宁等地，小叶海藻（羊栖菜）主产于福建、浙江、广东等地[1]。海藻的炮制方法为晒干、净制，近代本草中关于海藻的品质描述也以身干、色黑、霜少、枝嫩、无沙石者为佳。虽然海藻在我国用药历史悠久，药用价值明确，药用资源丰富，市场需求量大，但是关于海藻的质量控制方法和质量标准研究相对落后，对海蒿子和羊栖菜两者的功效差异、商品规格、质量差异等均未有明确的标准。笔者针对海藻的质量标准情况及质量控制技术进行综述，以期为加强海藻的质量控制、海藻资源的临床应用及开发等提供基础。
1 海藻质量标准研究现状
1963年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）开始收载海藻，至2020年版《中国药典》海藻的基源保持一致，均为海蒿子及羊栖菜的干燥藻体。历经10版药典，自1977年版《中国药典》以后，海藻的性状描述一直未加改动。1963年版《中国药典》及1977年版《中国药典》[12-13]均认为海藻“以色黑褐，白霜少者为佳”，之后历版药典再无类似描述。1977年版《中国药典》增加了【鉴别】项，该项目是甘露醇的化学反应，反应原理为甘露醇与三氯化铁试液反应生成棕色沉淀，再加氢氧化钠试液后沉淀溶解。1990年版《中国药典》[14]【鉴别】项删除了后半部分滴加过量氢氧化钠试液后沉淀溶解的试验。2015年版《中国药典》[15]中海藻在原有基础上增加了【检查】项及【含量测定】项，并在【检查】项下规定了水分、重金属及有害元素（铅、汞、镉、铜）的限度。此外，【含量测定】项下使用蒽酮-硫酸显色法采用紫外分光光度法进行测定，以岩藻糖计算海藻多糖的含量，规定其不得少于1.70%。海藻的质量标准由简单的性状描述提升至条目相对完整的质量体系。
全国有20个省、自治区、直辖市的中药材炮制规范收载了海藻的炮制方法。绝大部分地区炮制方法基本与《中国药典》一致，均为净制后切段，仅甘肃省收载的炮制方法为净制后切丝。2010年版《湖南省中药饮片炮制规范》另收载了海藻超微饮片。就质量标准而言，《上海市中药饮片炮制规范》中质量项目最全面，覆盖【鉴别】、【检查】、【含量测定】。其他地区的炮制规范的标准相对简单，有的仅有炮制方法，无相应炮制后对药材性状的描述，具体详见表1～2。
表1 历版《中国药典》海藻标准的变化
表2 各地方炮制规范收载情况
由此可知，目前海藻的质量标准相对简单，无特征性的质量控制项目，存在一定的缺陷。对海藻的质量控制方法进行梳理，建立海藻质量特征性控制方法是迫在眉睫的。
2 海藻的质量控制方法现状
影响中药材质量的因素有很多，质量控制的方法也多种多样。《中国药典》通常分3个方面来进行药材整体质量的控制。（1）原植物来源的控制，即保证药材的基源、药用部位、成熟度等正确；（2）外源性物质的控制，如水分、灰分、农药残留量、二氧化硫残留量、重金属含量等；（3）指标性成分或者功效性成分的控制，如含量测定和浸出物。下面将从这3个方面阐述海藻药材现有的质量控制方法。
2.1 基源的控制 传统的药材鉴别一般依靠经验鉴别，即从外观、断面、色、味、质感等多方面综合评价药材的真伪。随着技术的发展，显微技术成熟以后，显微特征成为辨别药材真伪的重要特征。其利用显微镜对中药材（饮片）、粉末及含粉末的制剂中的组织、细胞或者内含物等特征进行鉴别，具有专属性和易操作性，是中药材质量控制的常用方法之一。现行《中国药典》及各地方标准中海藻项下均无显微特征相关项目。海藻属于马尾藻属植物，在褐藻门藻类植物中分化较为复杂，生长环境不同，其藻体的外形差异也大，仅仅依靠藻体的外形来鉴定具体品种，鉴定难度系数高，通常会导致市场上混伪品多，正品难寻。董焱等[41]通过性状和显微特征对海藻及几种类同品进行鉴别，发现羊栖菜主干横切面髓部较大，由类圆形小细胞紧密排列而成，叶状体横切面表面波浪状细胞狭长，外被蜡质薄膜，内含大量黏液质，纵向紧密排列。海蒿子主干横切面的髓部为多角细胞组成，叶状体横切面中表皮由椭圆形纵向紧密排列的细胞组成，外壁披蜡质薄膜；中间部隆起，具有类似叶脉状结构，由此可将其与另外5种马尾藻属植物区分开。因此，开发显微鉴别的方法，辅助性状鉴别，可提升海藻基源鉴定的准确率。
2.2 外源性物质的控制 随着海洋资源的开发与利用，海洋的环境也受到影响，污染问题也随之而来。重金属、有机物、农药等残留随着径流、雨水冲刷等途径进入海洋，是海洋重要污染物之一。20世纪90年代，接连发生多起“中药重金属超标”事件后，人们开始重视中药材中外源性污染物的影响，《中国药典》也开始完善重金属、二氧化硫、农药残留量、真菌毒素等污染物的检验检测方法。2020年版《中国药典》中二氧化硫残留量及33种禁用农药残留量是植物类中药材的必检项目。关注较多的重金属残留量也有很多的文献报道。
2.2.1 重金属污染 海洋植物重金属的含量与海域分布有关，藻类通过生化反应吸附海水中的重金属离子，有可能引起重金属的富集。对人体毒害最大的重金属有汞、镉、铅、砷、铬等。常用的重金属检测方法有原子吸收光谱法（AAS）、氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等。在《中国药典》中铅、镉、汞、砷、铜5种重金属的检测即用到AAS和ICP-MS。AAS检测成本相对较低，其灵敏度也能满足重金属检测的需求，但分析多种元素需要选择不同的离子化方式，操作复杂。ICP-MS是利用以电感耦合等离子体为离子源，进入质谱仪进行检测，具有分析范围广、灵敏度高、线性范围宽的特点，常用于药材中各种微量元素的含量测定。陈星星等[42]采用ICP-MS测定浙江沿海藻类多种重金属的含量，发现羊栖菜中铅、砷含量较高，需要重点关注。陈发荣等[43]用毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱（CE-ICP-MS）联用测定羊栖菜中的总砷及各种形态砷的含量，结果显示羊栖菜中主要是未知结构的有机砷。原子荧光光谱（AFS）检测原理是原子态的待测物能发射一定特征波长的荧光，其荧光强度与待测物含量成正比。氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）是我国20世纪60年代发展起来的一种新型检测技术，仪器具有灵敏度高、操作简单、检出限低、抗干扰能力强的特点，该技术常用于汞和砷的检测。张金玲[44]采用HG-AFS法测定羊栖菜中总砷的含量，其总砷含量为40.208 mg/kg，远高于其他品种。此外，砷的毒性不仅与砷的总量有关，还与砷的形态密切相关，液相色谱与氢化物发生-原子荧光光谱法的联用技术（HPLC-HG-AFS）常用于砷形态的分析。于卓然[45]利用HPLC-HG-AFS法研究海洋藻类中砷的形态，该方法检测分析简便、快速、灵敏度高，可以检测和确证6种不同形态的砷，可以更为具体地检测海藻样品中主要砷的形态含量。
2.2.2 农药的污染 农药的种类繁多，陆地上使用的农药可以通过雨水冲刷进入海洋生态中。我国水体受到有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类农药的广泛污染[46]。农药本身具有易富集、难降解、残留量高的特点。目前农药残留量通常采用气相色谱法（GC）、液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行检测。使用联用技术可以大幅提高检测目标物的品种，提高检测的效率。靳贵英等[47]使用气相色谱-串联质谱法测定海藻羊栖菜中的19种有机氯农残，发现样本中的有机氯的农药残留均低于检测限。彭全材等[48]对5种海藻中有机氯农残的含量进行分析，研究发现海藻中有六六六及滴滴涕类农药的残留。2020年版《中国药典》则将液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法联合使用测定中药饮片中33种禁用农药残留量。
2020年版《中国药典》及2018年版《上海市中药饮片炮制规范》中“海藻”项下规定铅不得过5 mg/kg、镉不得过4 mg/kg、汞不得过0.1 mg/kg、铜不得过20 mg/kg，未有砷残留量相关规定。今后的研究可根据海藻中重金属残留量的情况及农药污染的现状，对海藻中砷的残留量及砷的形态进行调研分析，探索砷残留量的控制方法。
2.3 功效性成分或者指标性成分的控制 海藻化学成分丰富，含有人体不能合成的必需氨基酸[49]、植物甾醇[50-51]、脂肪酸[52]、多酚类[53]化合物等。近年来，对海藻化学成分的研究主要集中在海藻多糖。海蒿子多糖和羊栖菜多糖均有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4-5]、降血糖[6-7]、免疫调节[8-9]等作用，是海藻重要的功效性成分及质量标志物。海藻的质量标准提高依赖于多糖检测技术的完善。但多糖结构复杂，单糖的种类、连接方式、连接位置、相对分子量、二级结构、三级结构等均影响多糖的质量。现行标准仅以蒽酮-硫酸法测定总糖含量，缺乏海藻多糖特征性检测方法。目前关于海藻多糖的研究主要集中在多糖的提取分离及药理作用方面，海藻多糖质量控制方法研究的文献较少。因此，本文根据多糖结构特征将相对较成熟的多糖质量控制方式进行简单的阐述，为建立海藻多糖的质量控制方法提供参考依据。
2.3.1 多糖总量的测定方法 总糖含量的测定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸比色法和间接碘量法等。其中3,5-二硝基水杨酸比色法不适用于自带颜色样品的检测，间接碘量法受到滴定速度的影响较大，因此蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法是常用的检测方法。这两个方法操作简单，对仪器的要求低，仪器普及率高，接受度高。
2.3.2 单糖的种类和含量的检测 海藻多糖主要由岩藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖等[54-55]组成。检测多糖的单糖种类，需要先将多糖水解，主要的水解方式有酸水解及酶水解等。单糖种类主要的检测方法如下。
2.3.2.1 薄层色谱法（TLC）TLC是一种快速的方法，可以对单糖的种类进行鉴别。目前暂无使用TLC法鉴别海藻多糖中单糖组成情况的研究，但是有研究采用TLC法对湖北麦冬多糖[56]、五味子多糖胶囊[57]中的单糖进行定性鉴别，为海藻多糖中单糖的组成研究提供了参考。
2.3.2.2 高效液相色谱法（HPLC） 由于单糖无紫外和荧光生色基团，采用HPLC法进行检测时一般采用通用型检测器，如蒸发光检测器（ELSD）、电喷雾检测器（CAD）或示差检测器（RID）。使用紫外（UV）或荧光检测器（FLD）时，需要将其进行柱前衍生化，其中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是常用的衍生化试剂。李溢真等[58]使用三氟乙酸降解提取到的海蒿子多糖中单糖的组成为甘露糖、半乳糖和岩藻糖。胡淑曼等[59]采用水提法提取海藻药材得到海藻粗多糖，经过三氯乙酸降解、PMP衍生后，采用紫外检测器，在254 nm处，利用HPLC测定海藻药材质量标志物岩藻糖的含量。研究者优化了单糖制备、柱前衍生及除去游离衍生试剂的条件。该方法相对蒽酮-硫酸显色法干扰因素小、精密度高、重复性好，可用于海藻药材的质量控制。
2.3.2.3 气相色谱法（GC）GC法比较适合中性多糖的测定，可搭配FID检测器测定多糖的组成。测定时需将水解后的单糖进行衍生化，该方法灵敏度高，但是衍生化过程中有副产物，需加以甄别。魏晓蕾等[60]利用该方法测定从海蒿子中分离纯化的3种褐藻糖胶，发现3种多糖均含有岩藻糖。
2.3.2.4 离子色谱法（IC） 离子色谱搭配电化学检测器也可以用于单糖的检测。该方法也无需衍生化。有研究在灵芝孢子粉多糖[61]和葛根多糖[62]的单糖组成检测中采用了IC法，发现不管是灵芝孢子粉还是葛根，其来源不同，多糖的单糖组成的亦不相同。
2.3.2.5 高效毛细管电泳法（HPCE）该方法分离效率高，有机溶剂消耗少，操作简便，也可以用于单糖组分的检测。林晓燕等[63]建立了柱前衍生-HPCE法分析太子参多糖中的单糖组成，该方法操作简便、耗时少、准确度高。
2.3.3 糖苷键的连接方式及连接位置 糖苷键是指连接糖分子苷元与糖基或者糖基与糖基之间的化学键，是多糖中重要的化学特征之一。其测定方法主要有红外光谱法（IR）、核磁共振波谱法（NMR）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等。
2.3.3.1红外光谱法（IR） 在红外辐射下，不同类型糖苷键特征吸收不同，可以鉴定多糖的构型。海藻多糖[6,58,60]的特征吸收是3 400 cm-1左右的宽峰，对应羟基的O-H；2 900 cm-1峰对应是C-H键的特征吸收峰；α糖苷键特征吸收峰约在840 cm-1，而β糖苷键的特征吸收峰约在890 cm-1，磷酸基在1 300～1 250 cm-1处有P=O伸缩振动峰；吡喃糖苷因有醚键C-O-C在1 100～1 010 cm-1处有3个吸收峰，而呋喃糖苷在相应的区域只出现2个峰。
2.3.3.2 气相-质谱联用法（GC-MS）GC-MS是最常用的测定糖苷键连接方式的方法：通常先将多糖样品中单糖的游离羟基全部甲基化，然后水解、还原后得到的羟基即为单糖残基的连接位点；再将产物乙酰化后得到具有挥发性的甲基化的糖醇乙酸酯进入GC-MS进行分析；根据质谱碎片的信息来判断结构。测试步骤较为繁琐，需要一定的解析图谱的能力。如王莹等[64]采用GC-MS法判断黄芪多糖中糖苷键主要有1,4、1,6位连接及端基葡萄糖。
2.3.3.3 核磁共振波谱法（NMR）核磁波谱是强磁场中的原子核吸收射频辐射形成的图谱，可以提供丰富的结构信息，是化合物结果鉴定的重要手段。核磁波谱一般分为氢谱和碳谱。氢谱[1H NMR谱、H-H COSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱]可推出单糖上各碳上氢的化学位移，碳谱[13C NMR谱和1H-13C COSY谱（HMQC谱和HSQC谱）]可推出碳的连接方式。NMR可以用来判断单糖残基的异头异构形式。霍山石斛的1H NMR谱显示多糖的异头氢信号在4.45～4.89 ppm之间；13C NMR谱显示异头碳信号在99.2～102.6 ppm之间，为β构型[65]。
2.3.4 分子量与分子量分布 凝胶渗透色谱法（GPC）是一种测定相对分子质量的方法，是目前2020年版《中国药典》四部通则中收载的相对分子量测定方法。该方法可对系列标识分子量的对照品进行测定，通过保留时间的不同来测定待测样品的相对分子质量及其分布。相对分子质量及其分布对多糖的控制有重要的意义，提取的多糖通常都需要测定此参数来控制多糖的质量。CAO C L等[6]用HPGPC测定海蒿子多糖的平均分子量为1.036×106Da。此方法在短葶山麦冬多糖[66]、灵芝提取物多糖[67]、黄芪多糖[64]、人参多糖[68]等中均有应用。
此外，还可采用多角度激光散射技术（MALLS）对多糖的分子量进行测定。多角度激光散射技术通常需要与示差检测器（RID）联用，选择示差检测器的一个数据作为浓度来源，计算分子量。如CHENG Y[69]等利用高效分子排阻色谱法（HPSEC）对酶切后的多糖进行分离，采用MALLS与RID联合检测太子参非淀粉多糖，发现其分子量范围为4.37×104～1.70×105Da。
2.3.5 多糖的指纹图谱 多糖的复杂性导致多糖的质量不能由单一的指标体现，因此提出了多糖的指纹图谱的概念。目前多糖的指纹图谱已由一元的指纹图谱发展为多元的指纹图谱。一元的指纹图谱是指多糖一个指标的指纹图谱，如有基于多糖的红外光谱或基于单糖组成的HPLC或GC的指纹图谱。一元指纹图谱可采用化学计量学方法，如主成分分析（PCA）、层级聚类分析（HCA）、偏二乘判别分析（PLS-DA）等分析不同图谱之间的相似度，进行定性的鉴定。由于多糖结构的复杂性，一元的指纹图谱并不能代表多糖的性质，因此多元指纹图谱开始应用于多糖的质量评价。如CHENG J等[70]研究发现完全水解多糖的HPLC指纹图谱或者GC指纹图谱不能完全区分不同产地的决明子多糖，但若将部分水解多糖的FI-IR指纹图谱与HPLC指纹图谱结合PCA分析，则可区分不同产地的决明子。有研究[69,71]使用定位酶切技术将多糖进行水解，结合荧光辅助凝胶电泳（PACE）和高效薄层色谱（HPTLC）分析水解产物，来定性鉴别不同来源的多糖。这些技术不仅仅关注糖的一级结构，开始探索多糖水解的方式和特征。多糖常用的水解方式有酸水解与酶水解。酶水解多糖可以产生特异性的水解片段，选择性高，反应条件温和，其产物比较稳定，在质量控制方面具有一定的优势。
2.3.6 多糖的高级结构 多糖的空间结构十分复杂，对空间结构的研究有助于解释多糖生理活性的构效关系，也可以对多糖的质量进行控制。多糖的高级结构的主要研究方法有原子力显微镜法（AFM）、X-射线衍射法（X-Ray）和圆二色谱法（CD）等。如JI X L等[72]采用AFM发现木枣中分离的酸性多糖是球形的结构。REN Y P等[73]发现藜麦多糖是无定形形式存在的，分离纯化后可以形成稳定的晶体结构。ZHANG W等[74]发现超声纤维酶提取的肉苁蓉多糖局部形成螺旋结构。这3种方法为研究大分子（包括蛋白质、多糖）空间结构的常用方法，可以为多糖提供丰富的空间结构信息。
2.4 其他质量控制方法 海藻的成分除多糖外，还有甾醇、岩藻糖、多酚类、植物激素类、氨基酸等多种物质。这些物质是否可以作为海藻含量控制的标志物，还需要进一步探索。将这些组分的图谱特征进行数学推导或采用统计学方法进行分析，同样可以鉴别海藻的真伪。
王琰等[75]采用红外光谱三级鉴定法对海藻药材及其混伪品的红外图谱进行分析，发现不同品种海藻一维谱图相似，具9个共有吸收峰，主要含糖类、蛋白质、不饱和脂肪酸、甾体等成分；然而二阶导数谱图和二维相关谱图差异较大，根据峰数、峰位、峰强的差异进行区分，可以快速鉴别海藻药材。张晓萍等[76]采用氨基酸全自动分析仪测定海藻及其混伪品中17种氨基酸的含量，经过聚类分析发现：海藻真品海蒿子、羊栖菜为一类，铜藻为一类，亨氏马尾藻、海黍子为一类，瓦氏马尾藻为一类。该方法聚类的结果与种质鉴定的结果一致，同时也证明《中国药典》收载的品种与其混伪品差异较大，不能代替使用。该法可以用于海藻及其混伪品氨基酸含量的定量分析及真伪区分。CHEN Z等[52]采用GC-MS绘制海藻中脂肪酸的特征图谱，发现4种马尾藻属海的脂肪酸特征图谱差异性较大，经过主成分分析（PCA）可以鉴别4种不同的海藻；使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）可以鉴别《中国药典》品种与地方习用品种。ZHANG X L等[77]建立了一种H-NMR的方法来测定海藻中的总植物甾醇，研究利用植物甾醇中特征质子信号H-3α进行定量，结果发现羊栖菜中植物甾醇的含量明显高于海蒿子。该方法不需要衍生化，也不需要被测物的标准品。
3 总 结
海藻在中国分布广泛，使用历史悠久，具有很好的药理活性。海藻主要的活性物质为海藻多糖，目前对海藻多糖的研究主要集中在与中医理论相符合的抗肿瘤、抗血管生成、抗炎等作用上。历版《中国药典》及各地方标准均有收录海藻，然而海藻的质量标准却十分简单，因此对海藻质量标准的研究是十分必要的。建议在目前标准的基础上增加显微特征、灰分及重金属限度等质量控制项目，从基源和污染控制两个方面提升《中国药典》中海藻的质量标准。
对于海藻标准进一步的完善，需要重点关注海藻多糖的研究，包括其单糖组成、分子量分布情况、糖苷键的类型及连接位置、空间结构等。海藻多糖与其活性功能的关系有待进一步明确，建立活性多糖的检测方法在质量控制上更具意义。笔者对海藻中多糖的检测方法进行了阐述，可以发现目前多糖的质量控制方法主要还是对于其初级结构（总糖含量、单糖组成、水解后的寡糖组成、糖苷键类型等）的控制。这些方法的准确性依赖于多糖的提取、分离、纯化等步骤的标准化。多糖的高级结构复杂，高级结构特征与生物活性之间研究尚不够深入，同时研究高级结构的仪器也相对比较昂贵，企业和检验检测机构的普及相对困难。多糖指纹图谱的研究相对活跃，可以在整体上反映多糖的真实质量，是多糖质量提高的方向之一。
综上所述，海藻的质量标准需多方面完善。海藻多糖的质量控制方法需要提高，可采用多种方法结合，如单糖组成、分子量和分子量分布、多糖总量、指纹图谱技术等，从而达到初步控制海藻质量的目的。同时加快标准化进程是海藻多糖控制的重要一步，包括标准化的提取、分离、水解步骤，标准品及对照品的制备等，以保证分析方法的稳定、可靠、准确。
