林 丽，马雪宁，任宇坤，杨素清，闫景东，安月鹏
（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是临床常见的一种慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病，亦称异位性湿疹。其病情迁延缠绵，给患者的生活造成严重影响[1]。AD的病因多与遗传因素、环境因素、免疫因素及皮肤功能障碍相关[2]，现许多学者认为辅助型T细胞1（helper T cell 1，Th1）/辅助型T细胞2（helper T cell 2，Th2）炎症漂移是其免疫因素中的关键机制[3]。临床上常应用糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等对AD进行治疗，但存在一定的不良反应且容易复发，在临床应用中受到一定的限制[4]。中医学认为AD发病与血热密不可分，且在血热的基础上，又经风邪袭表，入里化热，成血热风燥之势[5]。地黄饮出自《医宗金鉴》，由生地黄、熟地黄、玄参、当归、白蒺藜、牡丹皮、红花、僵蚕、陈皮、甘草组成。全方养血活血，祛风止痒，与AD的病机吻合[6]。本研究采用2，4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）反复刺激的方法诱导AD小鼠模型，观察地黄饮对模型小鼠的皮损炎症程度、脏器指数、病理变化、肥大细胞浸润情况的调控作用，同时检测血清IgE、Th1型细胞因子IFN-γ及Th2型细胞因子IL-4水平并对其与皮损炎症程度的相关性进行分析，以探寻地黄饮对AD小鼠的药效作用及机制。
1 材料与方法
1.1 动物 健康SPF级雌性BALB/c小鼠36只，体质量（20±2）g，6周龄，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。小鼠饲养环境空气流动，12 h/12 h明暗交替，温度（22±2）℃，相对湿度50%～70%，自由饮水进食，食用标准饲料，适应性饲养7 d。本次实验通过黑龙江中医药大学附属第一医院动物伦理委员会批准（批准号：20200911-06）。
1.2 试剂与药物 地黄饮（方药组成：制何首乌10 g，生地黄25 g，熟地黄15 g，玄参15 g，当归15 g，白蒺藜20 g，牡丹皮15 g，红花5 g，僵蚕15 g，陈皮20 g，甘草10 g），购自黑龙江中医药大学附属第一医院草药局，由王萍主任药师鉴定药材为正品。润燥止痒胶囊（批号：2206032）购自国药集团同济堂（贵州）制药有限公司；石蜡（批号：2203167）购自Leica公司；无水乙醇（批号：B221117-1）购自天津永大化学试剂有限公司；苏木素伊红染色试剂盒（批号：081622221111）购自Beyotime公司；甲苯胺蓝（批号：20220721）购自Solarbio公司；DNCB（批号：P2067548）购自damas-beta公司；小鼠免疫球蛋白E（IgE）酶联免疫试剂盒（批号：11/2022-YJ037602）、小鼠白介素-4（IL-4）酶联免疫试剂盒（批号：11/2022-YJ063156）、小鼠γ 干扰素（IFN-γ）酶联免疫试剂盒（批号：11/2022-YJ002277）均购自上海酶联生物科技有限公司。
1.3 仪器 4 ℃冰箱（海尔集团电器有限公司，型号：SC-320D）；-80 ℃冰箱（日本Panasonic公司，型号：MDF-382E）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-ZFD）；电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：ME104E）；高压蒸汽灭菌器（日本Panasonic公司，型号：MLS-3751L-PC）；纯水系统（美国Millipore公司，型号：TANKPE0600）；移液枪（德国Eppendorf公司，型号：3120000）；显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：BX53）；制冰机（常熟雪科电器有限公司，型号：IMS-50）；脱水机[科迪制冷设备（昆山）有限公司，型号：KD-TS3A]；轮转式切片机（德国Leica公司，型号：HistoCore MULTICUT）；生物组织摊烤烘片机[科迪制冷设备（昆山）有限公司，型号：KD-TI]；冷冻包埋机[科迪制冷设备（昆山）有限公司，型号：KD-BMIII]；恒温振荡器（上海一恒科技有限公司，型号：THZ-98AB）；低温离心机（美国Thermo公司，型号：SORVALL ST8/8R）；酶标仪（美国Thermo公司，型号：Mulitiskan FC）。
1.4 分组及造模 36只小鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、对照组、地黄饮低剂量组、地黄饮中剂量组、地黄饮高剂量组，每组6只。参考文献建模方法[7-8]，将小鼠背部3 cm×2 cm区域进行脱毛处理，除空白组外，其余各组第1、4、7天用移液枪向背部涂抹150 μL 1%DNCB溶液进行致敏激发皮损，并于第15、17、19、21、23、25、27天用移液枪向背部涂抹150 μL 0.5% DNCB溶液维持皮损；空白组在相同时间节点、相同位置涂抹等剂量的基质[V（丙酮）：V（橄榄油）=1:4]。实验共28 d，于第29天取材。若模型组小鼠背部出现水肿剥脱、糜烂渗液或干燥鳞屑，且皮损炎症程度评分与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），则造模成功。
1.5 药物制备及给药 地黄饮每剂药量为155 g，加入8倍蒸馏水并浸泡40 min，冷凝回流1 h提取药液并滤出；再加入6倍蒸馏水，冷凝回流40 min提取药液并滤出。将2次滤液合并混匀，于70～80 ℃恒温水浴箱中浓缩至1 g/mL，存于4 ℃冰箱中备用。对照组予润燥止痒胶囊，将3 g润燥止痒胶囊与5 mL 0.5%CMC-Na共同放入研钵，研磨至不会堵塞灌胃针即可，将溶液转置于10 mL量瓶后定容摇匀备用。于第15～28天每日09:00:00—10:00:00进行灌胃，1次/d。按照人与大鼠体表面积比例计算大鼠给药剂量，地黄饮低、中、高剂量组剂量分别为10.08、20.15、40.30 g（/kg·d）（剂量约为体质量70 kg成年人正常用量的0.5、1、2倍）；对照组剂量为780 mg/kg（剂量约为体质量70 kg成年人正常用量的1倍）；空白组、模型组予等体积生理盐水灌胃，3.42 mL（/kg·d）。
1.6 观察指标
1.6.1 皮损炎症程度评分 从第1天起每日拍照记录小鼠背部皮损变化。参照临床EASI评分方法，于实验第7、14、21、28天进行皮损严重程度评分，包括红斑、水肿/丘疹，表皮剥脱/抓痕，鳞屑/干燥4个方面，每项评分按0～3分的4级评分法，分值越大则皮损炎症程度越高，评分标准见表1。
表1 皮损炎症程度评分表
1.6.2 脏器指数 第28天给药后禁食12 h，第29天称取小鼠体质量，以1%戊巴比妥钠腹腔注射（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼球目内眦取血后处死，摘取脾脏及胸腺，称量质量，并计算脏器系数。脏器系数=脏器质量/体质量。
1.6.3 皮肤组织病理变化 将各组小鼠受损皮肤组织置于4%多聚甲醛溶液中固定后，制备成4 μm皮损组织石蜡切片，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及梯度乙醇脱蜡，苏木素染色5 min，伊红染色2 min后梯度乙醇脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察组织病理学变化并采集图像进行分析。
1.6.4 肥大细胞浸润情况 将各组小鼠受损皮肤组织切片、脱蜡，甲苯胺蓝染色5min，蒸馏水冲洗5min，95%乙醇分化2min，分别浸入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2 min，中性树胶封片，于显微镜下观察肥大细胞浸润情况并采集图像进行分析统计。
1.6.5 血清IgE、IFN-γ、IL-4水平 采用ELISA法检测小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平，将各组小鼠的血液置于2 mL圆底离心管，在4 ℃、3 000 r/min、离心半径138 mm的条件下离心10 min分离血清。设置标准品孔和样本孔，标准孔加不同浓度标准品50 μL，样本孔先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，每孔加入酶标试剂100 μL（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同），37 ℃温育60 min，洗涤，每孔先后加入显色剂A、B各50 μL，37 ℃避光显色15 min，加终止液50 μL终止反应，450 nm波长依序测量各孔OD值。绘制标准曲线并计算IgE、IFN-γ、IL-4含量。
1.7 相关性分析 分别将血清IgE、IFN-γ、IL-4与皮损炎症程度评分进行双变量回归分析，计算出相应的回归曲线方程和相关系数（r），探讨其与皮损之间的相关性。
1.8 统计学方法 通过SPSS 26.0及GraphPad Prism 8.0.2软件进行处理，计量资料以“均数±标准差”（）表示。应用单因素方差分析进行组间比较，LSD-t检验进行两两比较，重复测量计量资料采用重复测量资料的方差分析，双变量线性回归分析进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠皮损炎症程度评分比较 所有小鼠不同时间皮损炎症程度评分比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在时间效应。各组小鼠皮损炎症程度评分总体比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在分组效应。空白组小鼠背部未出现皮损，整体状态良好；模型组小鼠背部出现水肿剥脱及糜烂渗液，部分可见干燥鳞屑及苔藓样变，与AD典型表现相符，皮损炎症程度评分高于空白组（P＜0.05），说明DNCB能够有效诱导AD，造模成功。经治疗后，与模型组比较，其余各组皮损均呈不同程度改善。第21、28天，对照组及地黄饮低、中、高剂量组小鼠皮损炎症程度评分均低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）；地黄饮中、高剂量组皮损炎症程度评分低于对照组（P＜0.05）。时间因素与分组因素存在交互效应（P＜0.01），即各组小鼠皮损炎症程度评分降低幅度不一致。（见表2，图1～2）
图1 各组小鼠皮损图
图2 皮损炎症程度评分交互效应轮廓图
表2 各组小鼠皮损炎症程度评分比较 （，分）
表2 各组小鼠皮损炎症程度评分比较 （，分）
注：F时间主效应=9.501，P时间主效应=0.000；F分组主效应=34.486；P分组主效应=0.000；F交互效应=3.767；P交互效应=0.000；与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与对照组比较，dP＜0.05。
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2.2 各组小鼠脏器指数比较 模型组小鼠脾脏指数高于空白组（P＜0.05）；对照组及地黄饮中、高剂量组胸腺指数低于模型组（P＜0.01）；对照组及地黄饮低、中、高剂量组脾脏指数均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）；地黄饮高剂量组脾脏指数低于对照组及地黄饮低、中剂量组（P＜0.01）。（见表3）
表3 各组小鼠脏器指数比较 （，mg/g）
表3 各组小鼠脏器指数比较 （，mg/g）
注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与对照组比较，dP＜0.05。
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2.3 皮肤组织病理变化 空白组小鼠皮肤表皮较薄，表皮与真皮交界清晰，无水肿及淋巴细胞浸润；模型组小鼠表皮较厚，角质层存在角化过度或不全，棘层肥厚、水肿，真皮层较厚且伴有大量炎症细胞浸润，提示造模成功；对照组及地黄饮低、中、高剂量组表皮及真皮轻度肥厚，存在少量炎症细胞浸润。（见图3）
图3 各组小鼠皮肤组织形态 （HE，×200）
2.4 肥大细胞浸润情况 空白组小鼠皮肤真皮层中可见零星肥大细胞；模型组小鼠皮损部位真皮层肥大细胞数量高于空白组（P＜0.05），部分呈脱颗粒状态；对照组及地黄饮低、中、高剂量组肥大细胞浸润程度较低，肥大细胞数量低于模型组（P＜0.01）。（见表4，图4）
图4 各组小鼠皮肤真皮层中肥大细胞浸润情况（免疫组化，×200）
表4 各组小鼠皮肤组织中肥大细胞数目比较 （，个）
表4 各组小鼠皮肤组织中肥大细胞数目比较 （，个）
注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01；与对照组比较，cP＜0.05。
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2.5 各组小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比较 模型组小鼠血清IgE、IL-4水平高于空白组（P＜0.05），血清IFN-γ水平低于空白组（P＜0.05）；对照组与地黄饮低、中、高剂量组小鼠血清IgE、IL-4水平均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），血清IFN-γ水平均高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。（见表5）
表5 各组小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比较 （）
表5 各组小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比较 （）
注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与对照组比较，dP＜0.05。
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2.6 相关性分析 通过对治疗后模型组、对照组及地黄饮低、中、高剂量组小鼠血清中IgE、IFN-γ、IL-4水平与各组小鼠皮损炎症程度评分进行双变量回归分析，求得直线回归方程：Y=0.981bX+12.521（r=0.552，P＜0.05）；Y=-61.337bX+1214.837（r=-0.568，P＜0.05）；Y=7.865bX+204.306（r=0.558，P＜0.05），差异有统计学意义。（见图5）
图5 血清IgE、IFN-γ、IL-4 含量与小鼠皮损炎症程度评分相关性分析散点图与直线拟合
3 讨论
AD是一种全身炎症性疾病，常在儿童期初发，可持续至成年，严重影响患者的生活质量[9-10]。现代医学认为该病与机体免疫功能、遗传基因和皮肤屏障等因素相关，但具体发病机制尚不明确[11]。目前西医治疗特应性皮炎多采用糖皮质激素、抗组胺药、钙调磷酸酶抑制剂、光疗和生物制剂等手段[1]，虽可以取得确切治疗效果，但其疗效持续时间较短，易产生药物依赖现象，停药后易反弹，且费用较高，导致患者接受度有限。中医药治疗AD可显着减轻皮损与瘙痒程度，减少迁延，在缓解症状及降低复发率方面具有一定的优势。
中医药治疗AD经历了长期的临床实践。《医宗金鉴·外科心法要诀》记载：“血风疮证生遍身，粟形搔痒脂水淫，肝肺脾经风湿热，久郁燥痒抓血津。”“此证由肝、脾二经湿热，外受风邪，袭于皮肤，郁于肺经，致遍身生疮。形如粟米，瘙痒无度，抓破时，津脂水浸淫成片。”风湿热邪侵袭肝、脾、肺经，郁久化风，内外风邪共盛，耗血生火，灼烧阴津，瘙痒难耐，而致本病迁延难愈。本病患者内受湿热之邪，外感风邪，为本虚标实之证，与机体脾气不盛，正气不足相关[12]。故中医学认为AD患者平素禀赋不耐，脾土运化不利，湿热内生，又外感风邪，入里化热，而成血热风燥之势，治宜凉血活血，搜风止痒[13-14]。地黄饮出自《医宗金鉴》。方中生地黄、熟地黄滋阴养血为君药。熟地黄偏补血，生地黄偏凉血，两者同用补而不燥[15-16]。何首乌生于春气，为风木之化而通肝经，生用重补益，制用重养血，临床实际应用时因其存在肝肾毒性，可酌情去之[17]。三者共为君药。当归补血活血，红花活血调经，两者助熟地黄养血活血之力。玄参濡润，既能滋阴，又能降浮火，与熟地黄相合攻补兼施。当归、红花、玄参共为臣药。僵蚕、白蒺藜祛风止痒平肝，牡丹皮清热凉血，陈皮顺气燥湿，共为佐药。甘草为使药，起调和之用。全方凉血活血，疏风止痒，补而不燥，凉润以滋养一身之肌表，攻补兼施，调理脾气，标本同治。药理学研究表明，生地黄、熟地黄、何首乌均具有调控免疫系统作用。目前，地黄饮已广泛应用于特应性皮炎的临床治疗，临床疗效佳，但其治疗AD的作用机制研究较为少见。基于此，本研究拟制备AD小鼠模型，以地黄饮进行干预，探讨地黄饮治疗AD的效果，并基于Th1/Th2免疫失衡机制进一步探索其可能作用机制。
免疫失衡为AD发生发展过程中最为重要的病理环节，尤以Th1/Th2失衡为主。两者失去动态平衡并向以Th2型细胞为主的免疫环境倾斜[18-19]。Th2型细胞能够产生大量IgE及IL-4等炎症细胞因子[20-21]，IL-4亦可间接活化肥大细胞[22]。活化的肥大细胞可产生一系列炎症因子，与B淋巴细胞、T细胞等相互作用，进一步引起炎症级联反应[23-24]。同时，大量分泌的Th2型细胞因子与以IFN-γ为主的Th1型细胞因子形成拮抗[25]。此外，经上述反应后，效应T细胞在外周血中呈高表达状态，可诱导Th1型细胞凋亡并使Th2型细胞含量上升[26-27]。因此，抑制Th2型细胞因子表达、调控肥大细胞活化、减轻炎症反应在抑制AD的发生发展中至关重要。本研究结果显示，在DNCB的刺激下，小鼠真皮层增厚并伴大量炎症细胞浸润，皮损炎症程度评分升高，肥大细胞数量增加，脾脏指数上升，小鼠血清IgE、Th2型细胞因子IL-4水平上升，Th1型细胞因子IFN-γ水平下降，说明DNCB能够加速肥大细胞脱颗粒进程，促进其活化，并同时对Th1/Th2炎症平衡造成影响。结果显示，地黄饮可改善小鼠皮肤组织炎炎症细胞浸润情况，降低皮损炎症程度评分，减少肥大细胞数量，降低小鼠血清IgE、IL-4水平而升高IFN-γ水平，说明地黄饮能够减轻肥大细胞活化，并可能通过影响脾脏功能而降低淋巴细胞的募集，促进倾斜于Th2型细胞的免疫环境回正，改善炎症反应。且地黄饮高剂量组的效果较优。同时，血清IgE、IL-4与小鼠皮损炎症程度评分呈正相关关系，IFN-γ与小鼠皮损炎症程度评分呈负相关关系，亦证明地黄饮可能通过调控Th1/Th2免疫平衡环境而对AD起到治疗作用。
综上所述，地黄饮能够明显减轻AD小鼠的皮肤炎症细胞浸润，改善皮肤病理情况，降低淋巴细胞募集、B细胞的产生及肥大细胞活化，降低血清IgE水平并调控炎症环境。地黄饮可能通过减少肥大细胞浸润，使免疫环境向Th2型细胞偏移的程度降低，减少Th2型炎症因子分泌而对AD起到治疗作用。
