★ 李养学 谭志灿 李素梅 江洁怡 程青云 彭丽诗 (.广东省中医研究所 广州50095;.广州中医药大学 广州50405)
复方归芍胶囊是广东省第二中医院医院制剂，由当归、白芍、黄芪、白术、柴胡、延胡索、阿胶、茯苓等药物组成，具有气血双补、调经止痛、健脾利湿的功效，在临床上用于治疗气血不足、脾不统血之月经不调、痛经等症。为了更好地控制其内在质量，保证临床疗效，本文采用薄层色谱法对方中当归、白芍、黄芪和柴胡进行了定性鉴别，采用高效液相色谱法对方中阿魏酸的含量进行了测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国);Camag Automatic TLC Sampler 4 全自动薄层点样仪(瑞士);Camag Reprostar 3 薄层成像系统(瑞士);KQ5200DE 型数控超声波清洗器(昆山);PBQ － II型薄层自动铺板器(重庆);DHG －9070A 电热恒温干燥箱(上海);Sartorius BP211D 分析天平(德国);HWS－26 电热恒温水浴锅(上海)。
1.2 试药
当归对照药材(批号:120927 －201014)、白芍对照药材(批号:120905 －200508)、黄芪对照药材(批号:120974 － 200508)、柴胡对照药材(批号:120992 －200504)、阿魏酸对照品(批号:110773 －200611)均购于中国药品生物制品检定所;复方归芍胶囊(批号:120801、120802、120803)由广东省第二中医院制剂室提供;乙腈为色谱纯，水为双蒸水;其余均为分析纯。
2 定性鉴别［1－4］
2.1 当归TLC 鉴别
取本品内容物5g，加1%碳酸氢钠溶液50mL，超声处理20 分钟，离心，取上清液，用稀盐酸调节pH 值至2 －3，用乙醚振摇提取2 次，每次20mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取缺当归的阴性样品5g，同供试品溶液制备方法制成当归阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010 年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(4∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(见图1)。
图1 当归TLC 图
2.2 白芍TLC 鉴别
取本品内容物5g，加乙醇50mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5mL，微热使溶解，放冷，通过D101 型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，以水50mL 洗脱，弃去水液，再用20%乙醇50mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇lmL 使溶解，作为供试品溶液。另取白芍对照药材0.5g，加乙醇10mL，超声处理5 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇lmL 使溶解，作为对照药材溶液。再取缺白芍的阴性样品5g，同供试品溶液制备方法制成白芍阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰(见图2)。
图2 白芍TLC 图
2.3 黄芪TLC 鉴别
取本品内容物10g，加水50mL，加热回流30 分钟，滤过，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取2 次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2 次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材3g，同法制成对照药材溶液。再取缺黄芪的阴性样品10g，同供试品溶液制备方法制成黄芪阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述3 种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰(见图3)。
2.4 柴胡TLC 鉴别
取“2.3”项下供试品溶液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取缺柴胡的阴性样品10g，同供试品溶液制备方法制成柴胡阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇－乙酸乙酯－稀氨水(1→10)(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰(见图4)。
图3 黄芪TLC 图;
图4 柴胡TLC 图
3 阿魏酸含量测定［1，5］
3.1 色谱条件
色谱柱:Agilent Extend C18(4.6 ×250mm，5μm)柱;流动相:以甲醇为流动相A，以1%醋酸溶液为流动相B，按表1 中的规定进行梯度洗脱;流速为1.0mL/分;检测波长为316nm;柱温为35℃。
表1 流动相梯度
3.2 对照品溶液的制备
取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1mL 含10.50μg 的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备
取本品内容物3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，称定重量，加热回流30 分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。
3.4 当归阴性对照溶液的制备
取当归阴性对照样品，按照“3.3”项下方法制备阴性对照溶液。
3.5 空白试验
分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定。结果阴性对照溶液色谱在对照品色谱相应的位置上，无其他色谱峰干扰，说明该方法专属性较好(见图5)。
3.6 线性关系考察
精密称取阿魏酸对照品适量，加70%甲醇溶解制成每1mL 含阿魏酸25.06μg 的溶液，分别精密移取1、2、3、4、5、6mL 于10mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度。精密吸取各浓度对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以阿魏酸的进样量为横坐标X，以色谱峰面积为纵坐标Y，计算回归方程，结果表明阿魏酸在25.06 ～150.36ng 范围内线性关系良好，其回归方程为:Y =6.3353X －6.6305，相关系数r=0.99999。
图5 阿魏酸HPLC 图
3.7 精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品溶液(10. 50μg/mL)10μL，连续进样6 次，其峰面积平均值为680.4381，RSD 为0.38%，表明仪器精密度良好(见表2)。
表2 精密度试验结果(n=6)
3.8 稳定性试验
取本品内容物(批号:120801)3g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 小时，18 小时进样10μL，测得其峰面积RSD 为0.43%，表明供试品溶液在18 小时内稳定(见表3)。
表3 稳定性试验结果(n=5)
3.9 重复性试验
取同一批次样品(批号:120801)，分别精密称取6 份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算阿魏酸的平均含量为0.0645mg/g，RSD 为0.68%，结果表明本方法有较好的重复性(见表4)。
表4 样品重现性试验(n=6)
3.10 加样回收率试验
取已知含量(0. 0643mg/g)的样品(批号:120801)6 份，每份约1.5g，精密称定，分别精密加入一定量的阿魏酸对照品，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算平均回收率为98.46%，RSD 为1.85%。结果表明:回收率较好，此方法可行(见表5)。
表5 加样回收率试验结果
3.11 含量测定
分别 取3 批 样 品(批 号:120801、120802、120803)，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定阿魏酸的含量，计算结果(见表6)。
表6 样品含量测定结果
4 讨论
4.1 对方中白芍进行薄层鉴别时，采用药典方法展开效果不佳。尝试多种方法后，最终采用D101 型大孔吸附树脂柱纯化样品，结果斑点清晰，分离效果好。
4.2 对方中柴胡进行薄层鉴别时，曾尝试多种制备方法及不同展开系统，最终采用文中所述方法，结果薄层色谱斑点清晰，分离度较好。
4.3 在阿魏酸的含量测定过程中，经过多次试验，最终采用甲醇－1%醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱，结果分离度较理想，阿魏酸峰形较好。另外，分别考察了提取方法，提取时间和提取溶剂等因素，结果以20mL 70%甲醇为提取溶剂，加热回流30 分钟，提取效果较佳。
5 结论
本文所建立的TLC 方法能准确、快速地鉴别方中所含当归、白芍、黄芪和柴胡，其TLC 特征斑点清晰，分离度好，阴性对照均无干扰;阿魏酸的HPLC含量测定方法操作简单，准确可靠，重现性好。上述方法可作为复方归芍胶囊的质量控制方法。
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