刘光华 ，于 艳 ，王思源，王贵帮，吴振起，刘 娟

1辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847；2辽宁中医药大学附属医院；3辽宁中医药大学研究生院

甘露消毒丹方首载于清代医家魏之琇所着的《续名医类案》中［1］，由滑石、茵陈、黄芩、连翘等药物组成，具有利湿化浊，清热解毒的功效，主治时疫侵体，湿温互结证，临床上广泛应用于多种病证［2-4］，表现为发热倦怠，或午后身热，颐肿口渴，呕恶，咽喉肿痛，肢酸，身目发黄，胸闷腹胀，泄泻，淋浊，尿短色赤，舌苔淡白或厚腻或干黄，脉濡数或滑数。甘露消毒丹为治疗湿热并重，毒邪蕴藉，肆逆气分的主要方剂，辨证属湿热毒蕴郁不解者，疗效显着。目前甘露消毒丹的提取尚缺乏质量控制方面的研究，而HPLC是化学科学中最有优势的仪器分析方法之一，尤其在有机、高分子化合物结构的确定方面具有优势［5］。故本实验采用 HPLC［6-8］波长切换法同时测定甘露消毒丹中绿原酸、黄芩苷、连翘苷3种成分含量［9-11］，为甘露消毒丹的质量控制提供一定的实验依据，同时为新药开发和临床应用提供科学基础。

1 仪器与材料

HH-4型恒温数显水浴锅（常州国华电器有限公司）；AR2140型电子天平（上海奥豪斯公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；美国Agilent 1100高效液相色谱仪；G1379A真空脱气机；G1311A四元梯度泵；G1313A自动进样器；G1315A柱恒温箱；G1315B二极管阵列检测器；Agilent B04.03化学工作站；AE-240电子分析天平；KH-400DB型数控超声波清洗器。中药饮片购自辽宁中医药大学附属医院中药房，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定均为正品；黄芩苷对照品（批号：110715-200514）、绿原酸对照品（批号：110753-200413）均购自中国药品生物制品检定所，连翘苷对照品（批号：16041519）购自北京世纪奥科生物技术有限公司，含量均大于98%。乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×250 mm，5 μm）色谱柱；检测波长0～20分钟为327nm；20分钟以后为230nm。柱温30℃；流速1.0mL/min。流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

在上述色谱条件下，理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000，分离度＞1.5，混合对照品与供试品色谱图，见图1。

图1 混合对照品与供试品色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、绿原酸、连翘苷对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇制成每 1 mL 含黄芩苷 39.8 μg、绿原酸 77.6 μg、连翘苷60.4 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 甘露消毒丹（滑石、茵陈、黄芩、石菖蒲、白豆蔻、藿香、木通、射干、川贝母、连翘、薄荷等11味中药饮片）经70%乙醇提取，回收溶剂，减压浓缩，进一步干燥得甘露消毒丹干粉。取本品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标一点法计算各成分的含量，即得。

2.5 线性范围考察 分别精密吸取混合对照品溶液 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积。进样量X（μg）与色谱峰面积Y经线性回归，得回归方程为：

绿原酸在 0.079 1～1.977 5 μg，黄芩苷在0.382 7～9.567 5 μg，连翘苷在 0.0652～1.6300μg范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，结果表明峰面积值的RSD分别为黄芩苷0.95%、绿原酸0.86%、连翘苷1.05%，表明本方法精密度良好（n=6）。

2.7 重复性试验 取供试品（70%乙醇提取）细粉6份，分别制备成供试品溶液，按样品含量测定方法测定，结果显示绿原酸、黄芩苷、连翘苷的平均含量分别为 0.536、4.099、0.364 mg/g，RSD 分别为绿原酸2.79%、黄芩苷3.57%、连翘苷2.10%，表明本方法重复性良好（n=6）。

2.8 稳定性试验 取供试品（70%乙醇提取）溶液，分别在 0、2、4、6、8、12 小时测定峰面积，结果表明峰面积RSD分别为黄芩苷2.73%、绿原酸1.11%、连翘苷1.47%，表明本品溶液12小时内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品0.25 g，共计6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（含绿原酸0.260 mg/mL，黄芩苷 2.095 mg/mL，连翘苷 0.170 mg/mL）2.0 mL，蒸干溶剂，按供试品溶液制备方法制备，进行含量测定，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率试验结果（n=6）

2.10 样品含量测定 取样品，精密称定，按上述方法制备成供试品溶液，再按本文选定的色谱条件测定峰面积，用外标法计算样品中3种成分的含量，结果见表3。

表3 样品中黄芩苷、绿原酸与连翘苷的含量测定 m g/g

3 讨论

甘露消毒丹以滑石、茵陈、黄芩为君药，其中滑石通水利淋，清暑解热；茵陈清利湿热，退黄；黄芩清热燥湿、泻火解毒；三药共奏利湿化浊、清热渗湿之效。以石菖蒲、白豆蔻、藿香为臣药，其中石菖蒲化湿和胃，涤痰辟秽；白豆蔻化湿行气，温中止呕；藿香芳香化湿，辟秽和中止呕；三药均辛温，宣泄气机，芳香化湿，于热从治，于湿正治，齐做臣药，尤宜于湿遏中焦之证。藿香、茵陈同用芳化清利、醒脾助运、清热化浊。余药为佐药，其中木通清利通淋，泄热，又助滑石、茵陈给湿热以出途；射干清热解毒，祛痰利咽；贝母化痰止咳，清热散结，配射干增强清肺利咽之功；连翘清热解毒，消痈散结，其轻浮可透达内外，携黄芩可强化彼此之效；薄荷疏散风热，清利头目，利咽为用；上五药共为佐药，彼此配伍尤能利咽化痰，开解散毒，畅达气机，通利水湿。诸药联用，以君三臣三佐五为制，具宣清降利之用，以利湿化浊，清热解毒为治［12］。目前研究［13-15］表明黄芩苷为黄芩发挥功效作用的主要指标性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、解热、镇痛、清除氧自由基等多种作用；绿原酸为茵陈的主要作用成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗内毒素、保肝等作用［16-18］；连翘苷为连翘的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗感染、解热、抗氧化等作用［19-21］。

本试验建立了HPLC法以测定甘露消毒丹中3种成分含量，即绿原酸、黄芩苷和连翘苷，检测过程采用波长切换方法，其中色谱图中显示绿原酸的最大吸收波长为327 nm，而连翘苷的最大吸收波长为228 nm处，黄芩苷的最大吸收波长为278 nm，由于黄芩苷和连翘苷均在230 nm处吸收峰峰形较佳，且分离度符合要求，为使操作简便、快速、易行，绿原酸在327 nm处进行检测，黄芩苷和连翘苷则将波长切换至230 nm处进行检测。试验中对供试品提取条件进行了考察，分别采用水，30%、50%、70%、90%乙醇作为提取溶剂，计算其提取效率。结果显示，采用70%乙醇作为提取溶剂可较好去除干扰杂质，所得绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量较大，提取较完全，效果最佳。本试验曾比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水流动相系统，比较各组分的保留时间与分离度，经反复尝试与摸索，结果乙腈-0.1%磷酸水的分离效果好，且稳定性、峰形均较好，拖尾因子及分离度均符合要求，且出峰时间适宜。故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为本试验的流动相。本试验建立了HPLC法测定甘露消毒丹中绿原酸、黄芩苷和连翘苷的具体含量，平均含量分别为2.389、28.362和4.354 mg/g，分离效果理想，重现性好，为临床应用及该方剂的进一步研究提供了试验依据。