应用5/6肾切除模型研究7首临床有效验方抗肾纤维化作用*

邵命海，何立群，谢婷婷，邹 赟，王 东，刘伟芳，黄 迪陈 刚，曹和欣，吴 锋，林日阳，吴同茹，刘英超

慢性肾衰的共同病变是肾脏纤维化，临床有众多方剂对慢性肾衰有效。为提高临床疗效，开发出抗肾纤维化的新药，旨在中医药理论指导下，分析文献报道，结合临床实践和众多专家意见，根据不同治则挑选出有一定研究基础的7首方剂，即健脾清化方［1-4］、肾衰 3 号方［5-7］、葆肾 3 号方［8］、慢性肾功能衰竭汤剂方［9］、滋补肝肾汤合化湿汤［10］、抗纤灵颗粒［11-14］和人参白术汤［15］作为研究对象，选用经典肾纤维化的UUO模型和大鼠 Platt模型［16］，动态评价与筛选方剂。这种通过2种模型比较不同治则肾衰方的对比研究并不多见，将为后期研究有效成分、组分与组分配伍的抗肾纤维化作用机制奠定基础，现先将Platt模型实验结果发表如下。

1 材料与方法

1.1 动物

健康成年雄性SD大鼠(SPF级)，8周龄，体重200g±20 g，由上海西普尔 －必凯实验有限公司提供。大鼠分笼饲养于25℃、12h光照、45%湿度的环境中，自由饮水，进食标准普通饲料。

1.2 造模方法

大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔注射，备皮，消毒手术区后铺巾，距左脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，经后腹膜暴露肾脏，分离肾周脂肪后，弧型切除2/3肾组织(主要切除皮质部分)，用明胶海绵压迫止血，当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾，缝合;1周后再次手术切除整个右肾。另取正常大鼠10只，仅作背部切口，分2次剥离左右肾包膜，保留肾上腺并作为假手术组。

1.3 动物分组

术后1周目内眦采血，测定肾功能，根据血清肌酐水平分为假手术组、模型组、健脾清化方组(JPQHR)、肾衰 3号方组(SS3R)、葆肾 3号方组(BS3R)、慢性肾功能衰竭汤剂方组(SGNSJR)、滋补肝肾汤合化湿汤组(ZBGSHSR)、人参白术汤组(RSBSR)、抗纤灵组(KXLP)和科素亚(Losartan)［17］对照组。

1.4 药物制备(由中药研究所制备提供)和使用剂量

健脾清化方:党参15g，生黄芪15g，草果仁6g，苍术10g，黄连3g，酒制大黄9g;大鼠用量按照人体6倍剂量(下同)换算为4.97g/kg/d。肾衰3号方:人参 10g，黄芪 30g，白术 15g，葛根 15g，淫羊藿 15g，制山茱萸 20g，何首乌 15g，丹参 10g;11.1g/kg/d。葆肾3号方:黄芪30g，丹参15g，酒制大黄9g，仙灵脾15g，虫草发酵菌粉9g，6.7g/kg/d。慢性肾功能衰竭汤剂方:人参10g，制附子10g，制山茱萸15g，猪苓 15g，泽泻 15g，益母草 30g，地龙 20g，川芎 15g，丹参30g，酒制大黄6g，16.8g/kg/d。滋补肝肾汤合化湿汤:女贞子12g，生黄芪30g，车前子10g，土茯苓10g，丹参 12g，川芎 15g，半枝莲 10g，生地黄 15g，制山茱萸 10g，枸杞子 10g，煅牡蛎 10g，12.3g/kg/d。人参白术汤:人参 10g，白术 6g，茯苓 6g，槟榔 6g，黄芪 6g，当归 6g，生地 6g，3.9g/kg/d。抗纤灵颗粒:丹参 15g，当归 15g，桃仁 12g，酒制大黄 12g，炒牛膝15g;5.9g/kg/d。对照药:科素亚8.6mg/kg/d，杭州默沙东制药有限公司提供。上述各中药组方均水煎浓缩备用，使用时稀释，控制灌胃体积2ml。

1.5 治疗方案

分组后每日药物灌胃1次共60d，假手术组和模型组生理盐水2ml灌胃。

1.6 观察指标及检测方法

(1)一般情况:死亡率、体重等;(2)血清尿素氮、肌酐和24h尿蛋白定量;(3)肾脏病理:取出左侧肾脏于 10%甲醛固定，备至石蜡切片，HE、MASSON染色，计算肾小球硬化指数(GSI)，采用Image-Pro Plus5.1图像分析系统计算MASSON染色蓝染纤维的阳性面积比例。

1.7 统计分析

应用 SPSS15.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较用单因素方差分析检验 ，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显着统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模大鼠出现不同程度的精神萎靡、体毛无光泽、摄食减少、身体消瘦、蜷缩等现象，治疗组大鼠进食增多，活动逐渐灵活。其中健脾清化方组体重明显大于模型组和其他治疗组(P＜0.05)，与假手术组相比无明显降低(P＞0.05)。

2.2 治疗后各组尿蛋白排泄的比较

表1显示，健脾清化方、滋补肝肾汤合化湿汤可降低24h尿蛋白定量(24hUP)(P＜0.05)，组间无差异，与科素亚疗效相当，其余各组无明显降低。

表1 治疗后各组尿蛋白排泄的比较Table 1 The urinary albumin excr etioncomparison after treatment

2.3 治疗前后肾功能比较

表2显示，造模成功大鼠根据血清肌酐(Scr)分组，分组后各治疗组和模型组尿素氮、肌酐基线水平无学差异(P＞0.05)。治疗60d后，血清尿素氮水平肾衰3号方组无明显下降(P＞0.05);其余各中药复方组降低(P＜0.05)，组间差异无意义(P＞0.05)。肾衰3号方组 Scr下降(P＜0.05)，其余各治疗组显着下降(P＜0.01)。

表2 治疗前后各组血清尿素氮和肌酐水平比较Table 2 Before and After Treatment BUN and Scr Level Comparison

2.5 肾脏病理

肉眼观察:模型组和各治疗组残呈肾代偿性肥大，颜色黯红，表面有多数隆起，和周围组织无明显黏连，残肾易分离。

光镜:假手术组肾小球未见明显异常;模型大鼠小球增生、肥大，系膜细胞轻度增生，可见局灶节段性球囊黏连和硬化，基质增宽不明显，肾小管偶有轻中度变性，偶见小管内蛋白管型，间质有炎性细胞浸润，蓝染纤维在系膜区、小球周围明显增加;各治疗组病变明显减轻，健脾清化方组、抗纤灵组病变减轻更明显，人参白术汤对病理损害的减轻作用较差。

进一步将MASSON染色切片进行半定量分析，对肾小球硬化程度评分:采用Raij等的半定量方法评估肾小球硬化程度，高倍镜(×400)下每张切片随机选取均观察6个完整肾小球，根据肾小球硬化灶所占比例分为0～4级(0为肾小球无病变，1级为肾小球受损伤不足25%，2级为肾小球受损伤不足26% ～50%，3级为受损伤51% ～75%，4级为受损伤76% ～100%)，然后计算 GSI;同时采用 Image-Pro Plus5.1图像分析系统计算蓝染纤维的阳性面积比例。表1显示，各中药组GSI和蓝染纤维阳性面积率减少(P＜0.05)，健脾清化方和抗纤灵组有显着差异(P＜0.01)，与人参白术汤组比较有差异(P ＜0.05)。

表3 治疗后各组肾小球硬化指数(GSI)和蓝染纤维阳性面积率比较Table 3 After Treatment，the GSI and MASSON Dyeing Aizen Fiber Positive Area Rate Comparison

3 讨论

慢性肾衰病机错综复杂，辨证分型变化多端，临床用于治疗本病的方药众多，仅我院治疗慢性肾衰就有抗纤灵颗粒、肾衰冲剂系列方。为提高临床疗效，创制疗效确切、组分明确、机理清晰的现代中药，挑选不同治则的7首有效临床验方通过Platt大鼠模型对比研究，发现各方都可改善一般情况，降低血肌酐，减轻肾脏病理损害。通过对比发现，补气活血、清化湿热、攻补兼施的健脾清化方和抗纤灵，较以补虚为主的肾衰3号方和人参白术汤改善肾纤维化和肾功能的作用更明显，可能有以下几个原因:(1)补气活血、清化湿热、攻补兼施的治则更切中慢性肾衰的“正虚邪实，虚实夹杂”病机特点;(2)与2006年［18］中华中医药学会肾病分会辨证分型试行方案中正虚和邪实分型一致;(3)与临床证候调查结果契合［19、20］:正虚以脾肾气虚型为多，邪实则是湿热瘀血贯穿疾病始终，脾肾气虚兼湿热瘀血是最主要的证型;(4)比较符合研究现状，众多使用补肾活血、清化湿热方药［21、22］可以抗肾纤维化，延缓肾衰进展。

总之，采用同一模型，挑选不同治则、角度各异的有效临床验方，进行干预肾纤维化的对比研究，发现补气活血、清化湿热、攻补兼施的中药验方优于单纯补益剂，说明健脾益气、清化湿热兼以活血化瘀作为临床最常用的慢性肾衰治则，具有其内在的科学性和重要的临床价值。同时，从中得到一个新的提示，除活血化瘀和清化湿热类药物可以抗肾纤维化，延缓肾病进展，单纯补益脾肾的中药也有一定的作用，其作用机制有待进一步的探索。

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