苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤的C6胶质细胞凋亡与自噬调节作用❋

郑 宏，张昕洋，鲁雨荍，曾子修，梁 晓，刘雪梅△(. 北京中医药大学东方医院，北京 00078； . 北京中医药大学，北京 0009)

【方药研究】

苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤的C6胶质细胞凋亡与自噬调节作用❋

郑 宏1，张昕洋2，鲁雨荍1，曾子修2，梁 晓2，刘雪梅1△
(1. 北京中医药大学东方医院，北京 100078； 2. 北京中医药大学，北京 100029)

目的: 研究苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤C6胶质细胞凋亡与自噬的调节作用，明确其对氧糖剥夺损伤胶质细胞的保护作用。方法: 采用氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的方法建立C6胶质细胞损伤模型，按随机数字表法分为空白对照组、氧糖剥夺/复氧模型组、苦碟子注射液组、自噬抑制剂(3-MA)组4组，AnnexinV FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，免疫荧光染色法观察活化caspase-3 表达， western blotting 法检测LC3II蛋白表达。结果：氧糖剥夺/复氧损伤后LC3II蛋白表达增加，细胞凋亡率升高，苦碟子注射液能够显着降低C6胶质细胞凋亡率，增加LC3II蛋白高表达。结论：苦碟子注射液能够降低C6胶质细胞凋亡率，进一步激活细胞自噬而发挥保护作用。

C6胶质细胞；氧糖剥夺；急性脑梗死；凋亡；自噬

缺血性脑卒中是由于供应脑部的血管狭窄或者发生急性闭塞，从而导致该供血区域的脑组织出现功能障碍的疾病，具有高发病率、高死亡率及高致残率等特点，是对人类健康及生存构成严重威胁的主要疾病之一[1-2]。胶质细胞约占中枢神经系统细胞总数的90%，不仅具有支撑、提供营养及协助代谢等辅助作用，而且参与神经元的通讯并促进突触形成和神经再生等功能。

自噬作为自体修复的重要过程，适度激活可能帮助清除受损的细胞器和异常蛋白，防止蛋白聚集，抑制细胞凋亡，防止细胞死亡，从而对细胞起保护作用。也有研究认为，自噬会直接导致细胞的死亡，并与凋亡信号存在交互作用[3-4]。苦碟子注射液具有活血止痛、清热祛瘀的功效，广泛应用于中风病急性期的治疗。研究发现，苦碟子注射液可以保护急性脑缺血再灌注损伤大鼠，降低脑梗死体积[5]。其对氧糖剥夺损伤的C6胶质细胞是否具有保护作用，其作用机制与细胞凋亡和自噬是否有关联？目前尚未阐清。本文探讨自噬和凋亡在胶质细胞中的调节作用，并运用苦碟子注射液组对此进行干预，阐释其治疗急性脑梗死的细胞机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

大鼠C6胶质瘤细胞株购自北京协和细胞资源中心(货号3111C0001CCC000131)。

1.2 主要试剂

苦碟子注射液(碟脉灵，通化华夏药业有限责任公司，批号140304)，无糖Kreb’s液(Macgene，CM012)，1640培养基(Gibco，11875-085)，胎牛血清(ScienCell, 0025)，AnnexinV FITC/PI检测试剂盒(Roche，11684795910)，RIPA裂解液(Sigma，R0278)，磷酸酶、蛋白酶抑制剂(Thermo，78443)，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo，23225)，抗β-actin兔多克隆抗体(Santa Cruz，sc-47778)，cleaved caspase3 兔单克隆抗体(CST，9664)，LC3II 兔单克隆抗体(CST，3868)，羊抗兔IgG-HRP(Jackson，111035003)。

1.3 主要仪器

倒置荧光相差显微镜(Olympus，IX71)，模块化低氧培养装置(Billups-rothenberg，MIC-101)，测氧仪(Nuvair)，激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，FV500)，流式细胞仪(Beckman，FACS-420)，Mini-垂直电泳系统(Invitrogen，121201-0899)，转膜系统(Bio-RAD, 153 BR 65818)，凝胶成像分析仪(Gene，5000P91DW)。

2 方法

2.1 细胞培养及收集

细胞复苏后24 h更换新鲜生长培养基(90% 1640培养基+10%胎牛血清)，待细胞密度增加至90%以上时0.25%胰酶消化，收集细胞用于western blot细胞铺于100 mm直径的细胞培养皿内。

2.2 氧糖剥夺/复氧损伤模型(OGD/R)

实验装置采用模块化缺氧培养装置。通入 95% N2和5% CO2混合气充分置换空气10 min后，将装置连同细胞放入37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h。缺氧时间结束后吸弃无糖 Kreb's 液，DPBS缓冲液漂洗1次，换成常规培养基，37 ℃、5%CO2培养复氧6 h。正常细胞组加入常规培养基，37 ℃、5%CO2中正常培养，时间与各模型组保持一致。

2.3 分组与给药方式

对照组(Control)正常培养的细胞；氧糖剥夺/复氧模型组(OGD/R)氧糖剥夺时间为24 h，复氧时间为6 h；苦碟子注射液组(KDZ)在氧糖剥夺的同时，给予苦碟子注射液1.25%浓度进行干预；自噬抑制剂3-MA对照组(3-MA)在氧糖剥夺的同时，给予10mM 3-MA进行干预。

2.4 AnnexinV FITC/PI双染检测细胞凋亡率

细胞加入0.125% 的胰蛋白酶0.5 ml，置37° 5～10 min进行细胞消化；加入含血清的培养液2 ml终止消化，吸管轻轻吹散细胞成悬液；1000 rpm离心8 min弃上清,加入2～3 ml冷的PBS液，轻轻吹打使细胞悬浮；1000 rpm离心8 min弃上清；加入100 μL的Binding Buffer轻轻吹打；加入5 μl Annexin/FIT和lul 100 μg/ml的 PI 溶液，再加入400 μl结合缓冲液轻轻摇匀，室温下避光反应30 min加入200 μL的Binding Buffer轻轻摇匀后，用200目筛网过滤；激发波长为488 nm，发射波长分别为530 nm和575 nm，流式细胞仪检测分析。

2.5 免疫荧光染色法观察细胞凋亡

细胞以 1×105/mL密度接种至 35 mm 培养于共聚焦专用培养皿内。吸弃孔内培养基，PBS液漂洗3 min×3次；4% 多聚甲醛固定，室温 15 min，PBS 液漂洗3 min×3次；3% Triton X-100 透膜，室温 20 min，PBS液漂洗5 min×3次；5% 山羊血清进行封闭，室温孵育 30 min；加入cleaved caspase-3兔单克隆抗体(1∶200)，4 ℃ 孵育过夜。吸弃一抗，PBS 液漂洗5 min×3 次；加入稀释的FITC标记山羊抗兔 IgG 荧光二抗(1∶500)，室温避光孵育 40 min。PBS液漂洗5 min×3 次；加入 DAPI 液(1∶200)，室温孵育15 min，PBS液漂洗5 min×3 次；在激发波长 488 nm、发射波长 527 nm条件下，激光扫描共聚焦显微镜拍照。

2.6 Western blotting法测定蛋白

2.6.1 细胞总蛋白的提取 细胞加入RIPA细胞裂解液 150 μl/孔，磷酸酶蛋白酶抑制剂1.5 μl/孔，冰上孵育30 min。细胞刮刀收集细胞，14000 rpm、4 ℃ 离心 15 min，保留上清即为总蛋白。

2.6.2 采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度 加入适量RIPA缓冲液，将各组蛋白浓度调整至相同浓度，95 ℃、5 min变性；使用10%SDS-PAGE预制胶进行电泳，湿转法转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭 1 h。TBST洗3次，每次10 min，加入用脱脂牛奶稀释的LC3II兔单克隆一抗(1∶1000)，4 ℃过夜，TBST洗3次，每次10 min；加入羊抗兔二抗(1∶5000)，室温孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；最后滴加ECL液显影、拍照，内参照用β-actin。图像采用Image J软件进行处理分析，计算灰度值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤C6细胞凋亡的影响

免疫荧光染色：采用活化的 caspase-3 荧光染色观察细胞凋亡情况。其主要作用于细胞质呈现绿色荧光，DAPI 作用于细胞核呈现蓝色荧光(荧光图见图1A)。

图1 苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤C6胶质细胞凋亡的影响注：A 荧光染色图；B 流式细胞图。

流式细胞术：表1显示，采用 Annexine V FITC/PI 双染法检测细胞凋亡率，4个象限中，右下代表早期凋亡，右上代表中晚期凋亡，左下为正常细胞，左上代表死亡的细胞(流式图见图1B)。

与正常组比较，OGD24 h/R6h模型组细胞绿色荧光增强(图1A)，位于细胞核的蓝色荧光出现固缩和分散状，且右下和右上象限的细胞增多，细胞凋亡率(35.87±2.67)%明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，提示细胞凋亡明显；与 OGD24 h/R6h 模型组比较，1.25%苦碟子注射液组和 3-MA 组的细胞绿色荧光减弱，右下和右上象限的细胞数量减少，1.25%苦碟子注射液组细胞凋亡率(14.25±0.34)%、3-MA 组细胞凋亡率(16.57±0.49)%均明显降低(P<0.01)，但仍高于正常组水平。

表1 苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤的C6胶质细胞凋亡率和LC3II蛋白的影响

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OGD/R模型组比较:#P<0.01

4.2 苦碟子注射对氧糖剥夺损伤的C6 细胞LC3II蛋白表达的影响

图2表1显示，western blotting法：正常组LC3II蛋白表达非常低，3-MA组细胞LC3II蛋白表达略高于正常组(P<0.01)。与正常组比较，OGD24 h/R6h模型组细胞LC3II蛋白表达明显增加(P<0.01)；与OGD24 h/R6h模型组比较，苦碟子注射液组LC3II蛋白表达进一步增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤C6细胞LC3II蛋白表达的影响

5 讨论

近年来学者们认为，脑的正常运行不仅仅是神经元的作用，而是依靠血管神经单元中各个成分的功能交互而实现，因此研究神经血管单元的意义十分重大[6]。本研究从胶质细胞入手，明确胶质细胞与自噬、凋亡的相关性，对于研究缺血性脑卒中的发病机制具有重要意义。

细胞死亡类型包括程序性死亡和坏死，而程序性死亡又分为凋亡(I型程序性死亡)和自噬(II型程序性死亡)。自噬过程是通过将受损细胞器、衰老细胞或者一些自身细胞内的异物用一个双层膜包裹形成自噬体后，再被运送至与溶酶体融合，从而降解自噬体内所包裹的内容物来完成[7-8]。微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)作为自噬相关基因Atg8的同源物，对自噬体的形成至关重要，是参与自噬体形成的标志分子[9-10]。当细胞发生自噬后，LC3 的表达明显增加，因此 LC3 的表达量可以准确地反映细胞自噬被促进或是被抑制的程度。LC3 的前体经过加工而形成 LC3-I，与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，从而形成 LC3-II。LC3-II 存在于自噬前体和自噬体膜上，目前已成为自噬体检测特异性较高的标志蛋白基因。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)是细胞发生凋亡的主要执行者，是细胞凋亡发生过程中的核心效应酶。缺血再灌注时可产生多种信号分子，它们作用于相应的底物，诱导 Caspase-3 激活，进而促使细胞发生凋亡。因此也将Caspase-3 称为“死亡蛋白”，它的表达标志细胞必定发生凋亡[11]。

有研究发现，局灶性脑缺血后缺血中央区主要表现为坏死，而缺血半暗带区主要表现为凋亡和自噬[12]。自噬与凋亡之间存在着复杂的联系，二者有着共同的上游信号(Ca2+、过氧化物等)，在应激的状态下可被单独激活或者二者同时被激活[13]。Ginet等在新生大鼠永久性脑梗死模型中研究发现，大鼠梗死侧皮层一些神经元不仅存在自噬的表达水平增高，同时还表现出凋亡。董琳等观察PC12 细胞氧糖剥夺/复氧损伤后细胞自噬及凋亡现象，发现随着氧糖剥夺时间的延长，细胞凋亡率显着增高，自噬相关蛋白呈先上升后平稳下降的表达趋势[14]。这些研究与我们的研究结果亦有部分一致性，即自噬在氧糖剥夺损伤的胶质细胞保护中起着重要作用，且与凋亡存在负相关的关系。

苦碟子注射液的主要化学成分为黄酮类、腺苷、倍半萜内酯类等。现代研究表明，苦碟子注射液可以抑制炎症反应，改善血管内皮功能，对脑缺血有一定的保护作用[15]。苦碟子注射液可降低急性脑梗死后患者IL-6、TNF-α水平,表明其可能从抑制炎症反应方面对脑梗死发挥治疗作用[16]。团队前期整体实验[17]研究发现，苦碟子注射液可以改善MCAO模型大鼠梗死部位病理形态，下调NF-KB的表达。应用人脑微血管内皮细胞的体外实验发现，苦碟子注射液可以下调高糖损伤细胞模型ICAM-1与VCAM-1的表达[18]。以上临床、整体实验、体外实验研究均表明，苦碟子注射液对急性脑梗死具有神经保护作用。本研究发现，苦碟子注射液治疗后可进一步激活自噬增强，降低细胞凋亡，保护胶质细胞，给予3-MA后LC3-II明显降低表明自噬被有效抑制。然而凋亡关键因子caspase-3的表达水平却有所升高，说明苦碟子注射液可能通过自噬与凋亡的共同调节而发挥神经保护作用。

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Effect of Kudiezi Injection between Autophagy and Apoptosis in C6 Glial Cells Exposed by Oxygen Glucose Deprivation

ZHENG Hong1, ZHANG Xin-yang2, LU Yu-qiao1, ZENG Zi-xiu2, LIANG Xiao2, LIU Xue-mei1△
(1.DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing1000178,China; 2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objectives: To study the regulatory effects of Kudiezi injection on the apoptosis and autophagy of C6 glial cells, which are exposed oxygen glucose deprivation / reoxygenation injury, and clarify its neuroprotective effect on glial cells damaged by oxygen and glucose deprivation. Methods: C6 glia cells were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD/R) stress. The cells were randomly divided into four groups: control group, OGD/R group, Kudiezi injection group and autophagy inhibit (3-MA) group. Apoptosis and cleaved caspase-3 were detected by Annexin V FITC / PI double staining and immunofluorescence staining. The protein expression of LCII3 was detected by western blotting. Results: Oxygen-glucose deprivation /reoxygenation injury C6 cells activated LCII3 protein expression increased, apoptosis increased significantly. Kudiezi injection could further activate autophagy and increase the protein expression of LCII3, while reduce the rate of apoptosis. Conclusons: Kudiezi injection can reduce the apoptosis, and further activate autophagy, and plays a protective role in C6 glia cells.

C6 glia cells; Oxygen deprivation; Acute ischemic stroke; Apoptosis; Autophagy

国家国际科技合作专项项目(2015DFA31130)-清热活血组分治疗急性脑梗死；国家重点基础研究发展计划项目(973项目)(2012CB518406)-治疗心血管疾病有效方剂组分配伍规律研究; 国家自然科学基金资助项目(81202683)-从胶质细胞TAK1-NF-kB通络调控炎症反应失衡切入研究清脑丸对急性脑缺血的干预效应机制

郑 宏(1966-),女，主管技师，从事中医药防治脑病实验技术研究。

△通讯作者：刘雪梅(1979-)，女，副研究员，医学博士，从事中医药防治脑病应用基础研究，E-mail:liuxuemei@bucm.edu.cn。

R285.5

B

1006-3250(2017)08-1154-04

2017-02-26