针刺对端粒酶敲除小鼠大脑海马区、皮质区Trk-B信号调节激酶表达的影响❋

林丽莉，庄婉玉，陈慧娥，吴 强，林 栋(福建中医药大学针灸学院， 福州 350122)

【针灸研究】

针刺对端粒酶敲除小鼠大脑海马区、皮质区Trk-B信号调节激酶表达的影响❋

林丽莉，庄婉玉，陈慧娥，吴 强，林 栋△
(福建中医药大学针灸学院， 福州 350122)

目的：探讨临床常用的不同针刺方法，手针、电针干预对端粒酶敲除小鼠大脑海马区、皮质区Trk-B信号调节激酶表达的影响。方法：端粒酶敲除小鼠按随机数字表法分为手针组、电针组、空白对照组各6只。电针组使用一对华佗牌不锈钢针具(0.3 mm×0.25 mm)对双侧足三里进行针刺干预，交替频率，强度0.5～1.2 mA，幅度2/100 HZ，每日30 min，连续干预7 d。 手针组使用华佗牌不锈钢针具(0.3 mm×0.25 mm)对双侧足三里进行针刺干预，每5 min捻转1次，每次30 min，空白对照组不做任何干预。采用Western blot 法检测大脑海马和皮质区域Trk-B的表达情况。结果：手针组小鼠在干预后自主活动程度较空白组均有所增加，海马区电针组与空白组对照组比较Trk-B表达明显增高；手针组与空白对照组比较Trk-B表达明显增高；但在皮质区电针组与手针组比较Trk-B表达明显降低；电针组与空白对照组比较表达明显降低。结论：电针对不同脑区Trk-B表达的影响不同，电针可促进海马区Trk-B的表达，相同的穴位刺激电针和手针的作用机制不同，可能与酪氨酸B(Trk-B)信号调节激酶表达有关。

电针；手针；酪氨酸B(Trk-B)；端粒酶敲除小鼠

近年来，对于端粒和端粒酶的研究表明，端粒酶在大脑神经前体细胞发育过程中存在着高表达，且在保护神经干细胞和神经祖细胞特性中发挥着至关重要的作用。端粒酶基因敲除小鼠正逐步成为目前人类研究衰老机制的一类重要模型。传统医学认为，衰老不是一种疾病，是每个人生命中必然发生且无法避免的正常生理现象。“老”是一个必然经历的生命阶段，“衰”是伴随“老”而出现的各种虚损不足的生命状态。“老而且衰”是必然经历的生命状态，而“老而不衰”则是中医养生的目标和追求[1-2]。针灸是中医用于防病治病、抗老防衰、延年益寿、养生保健的重要措施。现代临床观察也表明，针刺在延缓脑衰老、改善脑功能、减轻痴呆r症状方面的确有明显的效果[3]。本研究通过探讨不同针刺方式对端粒酶敲除小鼠大脑海马区、皮质区酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B，TrkB)表达的影响，探讨针刺延缓神经系统衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究使用的端粒酶基因敲除小鼠(telomerase-deficient，Terc-/-)由美国Jackson Laboratory引进(Stock#004132)，该模型动物是通过采用新霉素片段替换野生型C57BL/6J小鼠3号染色体的端粒酶基因，从而导致该类小鼠的端粒酶表达缺失(https:∥www.jax.org/strain/023535)。该动物由上海茂生衍生物科技有限公司代理引进(货号MS13-127)，并于福建中医药大学动物实验研究中心SPF级转基因动物室进行保种、育种。本研究选用SPF级第4代端粒酶基因敲除(Generation 4 Terc-/-)小鼠，待第4代小鼠3～4周龄时采用PCR法进行基因型鉴定。

1.2 动物分组及干预

根据基因鉴定结果选用纯合子Terc-/-小鼠共18只，按随机数字表法分为手针组、电针组及空白对照组各6只。电针组使用一对华佗牌不锈钢针(0.3 mm×0.25 mm)对双侧足三里进行针刺干预，交替频率强度0.5～1.2 mA，频率2/100 Hz，每日30 min，连续干预7 d。手针组使用华佗牌不锈钢针(0.3 mm×0.25 mm)对双侧足三里进行针刺干预，每5 min捻转1次，每次30 min。空白对照组不做任何干预。小鼠穴位定位参照《实验针灸学》中“常用实验动物针灸穴位图”。在第7天干预结束后进行取材，在小鼠麻醉后将小鼠断头暴露脑组织，取左右皮质及海马组织浸于无菌0.01 mol/L的PBS(预冷)中冲洗血渍，后将组织置于-80℃冰箱用于Western blot蛋白检测。

1.3 自主活动实验

采用小鼠自主活动测试仪(中国医学科学院药物研究所制造)分析受试小鼠的自主活动程度，由微电脑自动记录小鼠在实验过程中的活动次数，测试时间10 min，测试结束后记录小鼠的活动次数，每天于固定时间测试1次，连续2 d。

1.4 Western blot检测皮质区海马区Trk-B含量

脑组织蛋白提取及测定：将脑组织从-80℃冰箱取出称重,取100 mg 组织加500 μL 组织裂解液(普利莱基因有限公司提供)匀浆后，以12000 r/min 速度在4 ℃离心15 min，取上清液用于蛋白定量检测(BCA 蛋白定量检测试剂盒由普利莱基因有限公司提供);SDS-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE): 从上述提取的样品中取出20 μg总蛋白，用10% SDS-PAGE 在4 ℃、20 mA 条件下进行电泳。电泳结束后，在4 ℃、400 mA 条件下将蛋白质从SDS-PAGE 转到硝酸纤维素膜上;抗体免疫反应: 按产品使用说明书使用一抗Trk-B、β-actin (购自美国Thermo Fisher Scientific)及二抗(购自美国Santa Cruz Biotechnology)，一抗按合适比例稀释后加入硝酸纤维素膜中并覆盖膜的全部，4 ℃放置12 h以上；PBS清洗后加入二抗平稳摇动，室温2 h；化学发光显影及凝胶图像分析: 将显影和定影好的胶片进行扫描,目的条带采用Bio-Rad图像分析软件进行光密度积分值分析，以β-actin为内参，各蛋白与β-actin光密度积分值的比值作为蛋白表达含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠的自主活动实验结果

图1显示，手针组及电针组的小鼠在干预后自主活动程度较空白组均有所增加，且手针组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但手针组与电针之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组小鼠自主活动能力比较

2.2 各组小鼠皮质区Trk-B蛋白表达结果

图2显示，在皮质区手针组与电针组Trk-B表达存在差异，且差异有统计学意义(P<0.05)；电针组与空白对照组比较，Trk-B表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；手针组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组小鼠海马区Trk-B蛋白表达结果

图3显示，在海马区手针组与空白对照组比较，Trk-B表达增加，且差异有统计学意义(P<0.05)；电针组与空白对照组比较，Trk-B表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；手针组与电针组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 各组小鼠海马区Trk-B蛋白表达结果

3 讨论

3.1 端粒酶基因敲除小鼠神经系统衰老特点

随着端粒和端粒酶与衰老的相关研究不断深入，衰老的端粒相关学说逐渐成为研究热点。近年来，Terc-/-小鼠在衰老研究领域的应用也逐渐增多。Terc-/-小鼠是通过采用新霉素片段替换野生型C57BL/6J小鼠3号染色体的端粒酶基因组分，从而导致该类小鼠的端粒酶表达缺失，其后代均表现出以约3～5 kb/代速率进行性端粒缩短和末端融合的增加，当端粒低于临界长度会导致小鼠端粒功能紊乱[4-5]，进而表现出全身性多系统自然衰老征象，它们的皮肤、大脑、内脏和其他器官均发生老化，出现嗅觉衰退、不育、肠部和脾脏受损等疾病。 Terc-/-小鼠目前已广泛应用于肿瘤学、血液学、免疫学、生殖医学等各个领域的医学研究，近年来陆续将Terc-/-小鼠应用于神经系统退行性病变的相关研究[6-7]。有研究发现[8-12]，Terc-/-小鼠在中枢神经系统的衰老主要表现为脑部缩小、大脑早衰，海马区脑源性神经营养因子(BDNF, brain derived neurotrophic factor)表达低于正常，且易引起阿尔茨海默症、帕金森病等脑部衰老性疾病。笔者所在团队前期研究发现[13]，Terc-/-小鼠的行为学特点与正常小鼠比较，出现了增龄性的快速衰老现象。本研究结果表明，电针及手针均能改善端粒酶基因敲除小鼠的自主活动能力，但电针与手针比较差异无统计学意义。因此，Terc-/-小鼠的衰老特点与年龄密切相关，在外在体征、学习记忆能力及自主活动等行为学方面有增龄性的快速衰老现象。

3.2 电针与不同脑区Trk-B的表达

Trk-B即酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B，Trk-B)是由酪氨酸激酶原癌基因编码的一种神经营养素家族(Neurotrophins，NTFs)高亲和力受体。Trk-B作为BDNF高亲和力的功能性受体，通过与BDNF结合而启动细胞内信号传导途径，激活细胞内丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activitedporteinkinase/extraccllularsigna-lrelatedkinase，MAPK/ERK)、磷脂酶Cr(phospholipase-Cgamma，PLCr)和磷酷酞肌醇3激酶(phosphatidylinosito-l3-kinase，PI3k)等下游信号通路，发挥广泛的神经营养和神经保护作用，在神经凋亡和分子调控、神经损伤和再生、神经元的可塑性及神经退行性疾病治疗方面发挥了重要作用。国内外大量研究已证实，BDNF和Trk-B相互结合对阿尔茨海默症、帕金森病及其他神经退行性疾病所致的神经损伤具有明确的神经修复和再生的治疗作用，二者在神经疾病方面的治疗有着广阔的应用前景。Trk-B与BDNF是所有神经营养因子中惟一一对在时间和空间上协同表达的受体配体复合体，两者广泛分布于中枢神经系统，尤以大脑皮质及海马区域含量最高。有研究表明，随着机体的不断衰老，BDNF及其受体Trk-B在中枢神经系统退行性病变中，其mRNA表达明显下降[15]，且Trk-B的mRNA表达降低比BDNF含量降低更普遍，而中枢神经系统神经元Trk-B的mRNA表达量改变会影响其神经元的形态和功能改变，BDNF生物学功能的发挥，必须与其受体Trk-B结合才能实现，若阻断其信号传导通路，则BDNF不能发挥其生物学功能[16]。因此，Trk-B表达量对BDNF生物学功能的发挥，神经系统退行性疾病的治疗至关重要。

近年来大量临床实验研究表明，针刺可调节脑循环，改善局部血流供应，调整神经细胞电生理活动、生化反应机制和基因表达来保护神经细胞免受细胞毒的损害，保护脑组织，减轻脑损伤，增强神经网络的内部代偿，从而改善神经功能、延缓脑衰老、改善脑功能、减轻痴呆症状等。笔者所在团队前期研究已证实[6]，针刺可通过调节BDNF信号传导通路相关蛋白起到神经保护，改善神经系统退行性疾病所致的神经损伤。本研究结果表明，电针对皮质区Trk-B的表达起抑制作用，而对海马区Trk-B的表达起促进作用，提示电针在不同脑区对Trk-B表达的影响不同；海马作为学习记忆的关键部位是最易受衰老影响的脑区[17]，是一系列以进行性记忆力和认知功能减退等为主症的中枢神经系统退行性疾病的好发部位。本研究结果提示，电针可能是通过促进海马区Trk-B的表达发挥神经保护的生物学效应。

3.3 不同针刺方式对Trk-B表达的影响

传统针刺即手针是在刺入身体后施以提插、捻转等手法达到治疗效果的，是属于机械性刺激。电针相比手针，被认为不仅有针刺作用还有电流刺激作用。近年来的研究表明[18]，传统手针和电针对机体作用存在差异，在神经传导通路、对神经递质及免疫分子的影响等诸方面都存在差异。有研究发现[19-21]，手针和电针足三里穴对大脑产生不同效应，手针引起脑中大范围的激活，而电针则引起脑中大范围负激活，且手针和电针激活的脑区明显不同，表明手针和电针可能有着不同的调节机制。在临床研究中发现[26]，电针对痛症及神经损伤的治疗有优势，而手针在对免疫分子的调节方面存在优势。

本研究结果表明，手针和电针均可促进海马区Trk-B的表达，但在皮质区电针对Trk-B的表达起抑制作用较之手针更为突出，二者间的作用差异提示，手针与电针对中枢神经系统可能存在不同的作用机制。

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Expression of Trk-b Signal Pathway in Hippocampus and Cortex of Telomerase Knockout Mice by Acupuncture

LIN Li-li, ZHUANG Wan-yu, CHEN Hui-e, WU Qiang, LIN Dong△
(CollegeofAcupuncture,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

Objective: To investigate the acupuncture and electric acupuncture intervention that the different acupuncture method in the clinical commonly used, have expression influence on B (Trk - B) signal conditioning tyrosine kinases of the hippocampus region and cortex region in telomerase-deficient (Terc-/-) mice brain. Methods: A total of twenty-four (Terc-/-) mice were randomly assigned to acupuncture group, electric acupuncture group and control group. In the electric acupuncture group, used a pair of hua tuo brand eletroacupunture apparatus (0.3 mm×0.25 mm) acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, the eletroacupunture apparatus were connected with alternation of frequency and intensity of 0.5～1.2 mA, 2/100 HZ, for 30 min/d for 7d. in the acupuncture group, used a pair of hua tuo brand stainless steel needles (0.3 mm × 0.25 mm)acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, once every five minutes twisting for 30 min/d for 7d. the control group was used in reared under the same conditions without any intervention. Then for Western blot method on the Trk - B expression in the hippocampus region and cortex region. Results：In the hippocampus region, compared with the control group, the electric acupuncture group and the acupuncture group were increased significantly in the Trk - B expression; However, in the cortex region, compared with the electric acupuncture group, the acupuncture group and the control group were decreased significantly in the Trk - B expression. Conclusion: The electric acupuncture intervention has different influence on the expression of Trk - B in the different brain regions, and it can promote the expression of the hippocampus Trk - B; There are different mechanisms in the acupuncture and the electric acupuncture intervention when we acupuncture the same acupoint, it may be related to the expression of Trk - B signal conditioning tyrosine kinases.

Electric acupuncture; Acupuncture; Trk B; Telomerase deficient(Terc-/-) mice

福建省自然科学基金资助项目(2017J01540)-基于端粒酶活性相关的针刺抗衰老效应对Terc-/-小鼠海马神经元保护作用研究；福建省资助省属高校科研专项JK类(JK2016018/JAT160221)-自发热温灸针对慢性神经痛模型大鼠脊髓疼痛调控时效特征的研究

R245.9+7

B

1006-3250(2017)08-1129-03

2017-01-11

△通讯作者：林 栋(1977-)，男，副教授，E-mail：bluelike1@sina.com。