邵 季 王志成 张 欣 羊 扬＊

（1.扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州225009；2.扬州大学动物疾病检测与技术服务中心，江苏 扬州225009）

作为革兰氏阳性菌，链球菌在自然界中的分布十分广泛，有荚膜，多呈双球或短链形，单球菌也时常被发现。链球菌科不仅包含链球菌属，还包括乳球菌属。根据兰氏分类法，链球菌属被分成了20多种血清型，猪链球菌与豕链球菌都属于链球菌属，二者在生长形态上非常相似，细菌经革兰氏染色后，在光学显微镜下均呈现革兰氏阳性球菌形态，其在血琼脂平板上，呈现明显的β溶血。然而，尽管生长特型与形态相似，两者的毒力与致病力之间存在较大差异。

豕链球菌可以发挥人源与猪源致病作用，能对公共卫生安全造成一定影响，应当引起相关重视[1-4]。

2018年12月，扬州大学动物疾病检测与技术服务中心对江苏省东台市溱东镇送检的一例咽喉水肿、脑膜出血的病死猪进行检测，采集咽喉扁桃体，分离出一种菌株，该菌株显示出怀疑是猪链球菌的明显β溶血现象。为进一步确证该菌，本实验拟通过分子生物学手段及生化试验手段，对所分离疑似猪链球菌菌株进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料的分离培养

于血琼脂平板上，接种从送检死猪病料上无菌采集的心、脾、淋巴、扁桃体等组织，37℃培养16至24 h，挑取β溶血明显、表明光滑的菌落，进行后续试验。

1.2 生化试验

按照链球菌菌株的生化指标进行生化培养管鉴定，挑取纯化后的菌落，将菌株接种至生化管，37℃培养24小时，观察结果。

1.3 全自动快速生物质谱检测系统分析

将分离菌纯化培养，获取单菌落，在生物安全柜中涂布到MALDI靶板上，使其自然干燥；干燥后滴加70%甲酸溶液1μL，使其自然干燥；最后加入基质溶液1μL，使其干燥后，放入全自动生物质谱仪中，进行检测。

1.4 16s rDNA鉴定

利用16s rDNA法对菌株进行分型鉴定。单菌落接种于LB培养基中，过夜培养；取1mL菌液离心，pdw水洗涤，100μL灭菌超纯水重悬；煮沸5分钟后离心，将上清液用作随后的PCR实验的模板。对菌株的16s rDNA通过PCR方法进行扩增，由南京擎科生物科技有限公司对扩增的产物进行基因测序。在GenBank中进行Blast分析，获取本次测序的结果。

1.5 药敏试验

在超净台中用接种环挑取纯化培养后单菌落，平板划线布满整块平板，分别贴上相应药敏纸片，并在37℃培养箱中过夜培养，观察结果。

1.6 耐药基因及毒力基因检测

根据GeneBank数据库序列及参考文献报道，首先通过PCR方法，对相应基因进行扩增，设计合成共4对毒力基因引物。同时设计10对引物，对细菌相应耐药基因进行扩增检测。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果。耐药基因含其中ESBLs类3种，氨基糖胺类3种，喹诺酮类2种，头孢类2种；毒力基因含豕链球菌重要毒力因子红疹毒素A、B、C及链球菌溶血素O相应基因speA、speB、speC、slo。

1.7 小鼠攻毒试验

ICR小鼠分为4组，阴性对照组1只腹腔注射0.1mL生理盐水，其余三组各3只，按不同剂量稀释菌液每组腹腔注射0.1mL菌液（浓度分别为105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL），观察结果。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离

该分离物被革兰氏染色，表现为具有清晰链排列的革兰氏阳性细菌。在血平板上形成针尖大小、透明的β溶血菌落。

2.2 生化试验

该菌能发酵葡萄糖、乳糖等，MAG、PYR反应阳性，DPP、PMG、TMZ、精氨酸为阴性。

2.3 细菌鉴定

细菌16srDNA序列经PCR扩增，切胶回收后送南京擎科公司测序。序列经Genbank比对后，与数据库中豕链球菌具有99%同源性，与猪链球菌2型同源性为92%。随后对分离菌进行全自动快速生物质谱检测系统分析，经鉴定为豕链球菌。

2.4 药敏试验

通过药敏纸片法，对分离菌进行耐药性检测，该分离菌对氯霉素、庆大霉素等抗生素敏感，而对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南等耐药，具体结果见表1。

表1 耐药性试验结果

2.5 耐药基因及毒力基因扩增

对分离菌株进行耐药基因扩增，TEM基因检出阳性。对分离菌株4种毒力基因进行PCR扩增，均为阴性。

2.6 小鼠攻毒试验

试验组小鼠在注射分离菌悬液后未出现明显症状，与对照组在一周观察时间内无差异。

3 讨论

本病例中，送检病死猪呈咽喉水肿、脑膜出血，通过细菌学检查、生化鉴定初步判定为链球菌感染。分子生物学技术的发展将链球菌属分类由21种增至89种，之前尚未被分离或分类为链球菌的链球菌属的新成员已被重命名和定位。为进一步鉴定该分离菌种类，本研究随后对临床分离菌株进行分子学分析及质谱分析。

通过16s rDNA方法及质谱检验，临床分离和怀疑的链球菌菌株被鉴定为豕链球菌。 豕链球菌和猪链球菌的形态相似，尽管具有相似的生长特性，但致病性差异很大。猪链球菌病不仅对生猪的生产造成巨大损害，而且对人也有致病作用，是一种严重的人畜共患细菌感染性疾病；而国际上，对豕链球菌毒力的研究主要集中于人与猪，国内则报道了牛源感染病例。

通过药敏纸法对分离出的细菌进行耐药性测试，结果表明，分离出的细菌对氯霉素、庆大霉素等抗生素敏感，但对氨苄西林、头孢他啶和氨曲南具有耐药性。对分离菌10种耐药基因进行检测，ESBLs类TEM基因为阳性，与药敏纸片结果相对应。

随后对豕链球菌重要毒力因子红疹毒素A、B、C及链球菌溶血素O基因speA、speB、speC、slo进行检测，4种毒力基因均未检出。本菌可能通过其他毒力因子发挥人源致病作用。

本次研究的结果表明，尽管分离的链球菌对猪致病性较弱，但它可以存在于猪中，并有可能成为继发感染的病原体，应引起更多关注。豕链球菌对公共卫生安全能造成一定影响，在生产过程中，应注意工作人员的防护，避免交叉感染。