刘南
（上海原能细胞生物低温设备有限公司，上海201203）
阿莫西林胶囊是胶囊剂，填充物为白色或类白色粉末，主要成分是阿莫西林。阿莫西林胶囊成品以阿莫西林为主要原料，填充至蓝黄色的胶壳中。本单位生产的阿莫西林胶囊的胶壳是蓝黄色，型号1#，主要成分是食用级明胶。阿莫西林胶囊主要适用于敏感菌所引起的感染，即不能分泌β- 内酰胺酶的细菌。阿莫西林胶囊作为青霉素类的广谱抗生素，其抗菌谱范围较大，主要包括敏感性的球菌或杆菌所引起的上呼吸道感染、敏感菌所引起的泌尿系统感染、敏感菌侵染皮肤伤口造成的感染、敏感菌引起的急性支气管炎和下呼吸道感染等。
2015 版《中国药典》要求企业在对药品进行微生物限度检查时，应对微生物计数方法进行计数方法适用性试验，确保微生物计数方法适合该产品的微生物计数。本次试验的技术难点主要体现在对阿莫西林胶囊进行微生物限度检查时，样品中的抑菌物质可能会抑制样品中微生物的生长，导致出现假阴性的可能性。阿莫西林胶囊作为β- 内酰胺类抗生素，对革兰氏阳性菌和芽孢杆菌具有较强的抑制作用；对革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用，也就是说检验样品存在抑菌性，需要在试验过程中找到合适的方法消除抑菌性。根据2015 版《中国药典》四部通则，对于β- 内酰胺类抗生素，可加入β- 内酰胺酶用于中和毒性。
在药品的生产质量控制中要能够准确地检出样品中的微生物，使药品中的微生物检验不因检验方法的缺陷而出现明显的偏差。为保证产品微生物检验结果的可靠性，微生物计数方法须进行适用性试验，通过试验数据的客观性来判定方法的可靠性。
微生物回收时，如何去除样品中的抑菌物质，保证样品中的微生物能够被检出，避免出现假阴性的结果是一大难题。需要通过试验证明这种去除抑菌物质的方法是可靠的，不仅能够去除抑菌物质，还不影响微生物的检出。试验过程中注意设置合理的试验组和对照以判定试验是否存在系统误差。
β- 内酰胺类抗生素是一种杀菌剂，它能抑制细菌细胞壁中肽聚糖的形成，从而杀灭细菌。真菌细胞壁的主要成分是几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、纤维素、半乳聚糖等。因此β- 内酰胺类抗生素对真菌无抑制作用。阿莫西林胶囊属于β- 内酰胺类抗生素，因此对细菌的回收可以考虑在供试液中添加β-内酰胺酶，用来中和供试品中抑菌活性物质；霉菌和酵母菌则可以用平皿法回收。
1 试验材料与仪器
1.1 样品
阿莫西林胶囊，上海美优制药有限公司，规格：0.25g，批号：150703。
1.2 仪器设备
生物安全柜（型号：BSC-02IIA2，苏州安泰空气技术有限公司）；风热消毒箱（BZF-50，上海博讯实业有限公司）；生化培养箱（型号：LRH-70，上海一恒科学仪器有限公司）；霉菌培养箱（型号：MJX-250B-Z，上海博讯实业有限公司）；电热恒温培养箱（型号：SPX-250B，上海博讯实业有限公司）；电子天平（BSA-8201, 德国赛多利斯公司）；脉动蒸汽灭菌器（型号：SCM-D/JA，连云港千樱医疗设备有限公司）。
1.3 菌种
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC(F)98001〕、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC(B)10104〕、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC (B)26003〕、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC(B)63501〕、黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC(F)98003〕。微生物计数方法适用性试验，将上述的5 种菌株作为试验菌，标准菌株从中国医学细菌保藏中心采购且能溯源，工作菌株为第三代。
1.4 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），干粉培养基均由上海盛思生化科技有限公司生产。
1.5 试剂
稀释液：PH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液，上海盛思生化科技有限公司生产。
中和剂：β- 内酰胺酶，杭州北望生物技术有限公司生产。
表面活性剂：聚山梨酯80，国药集团化学试剂有限公司生产。
2 试验方法
2.1 菌液制备
将金黄色葡萄球菌的第二代标准贮备菌株、铜绿假单胞菌的第二代标准贮备菌株、枯草芽孢杆菌的第二代标准贮备菌株，分别挑出一环新鲜培养于胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中，33℃培养24 小时，得到第三代工作菌株；白色念珠菌的第二代标准贮备菌株挑出一环新鲜培养物，接种至沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）中，23℃培养3 天，得到第三代工作菌株；黑曲霉的第二代孢子悬液挑出接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，23℃培养7 天，用5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80 的PH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液将黑曲霉孢子洗脱。分别取上述浓菌液1ml 加至9ml 的PH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液中，10 倍梯度稀释至约为104cfu/ml。
2.2 供试液制备
称取阿莫西林胶囊10g，分别加PH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲 液 至100ml、200ml、500ml，37℃水浴，充分摇匀，使成1:10、1:20、1:50 供试液。
2.3 方法适用性试验
2.3.1 平皿法
试验组：取制备好的1:10、1:20、1:50 供试液分装至无菌试管中，每管装量9.9ml，分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液各 0.1ml （含菌量不超过104cfu/ml）。
菌液组：取PH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液分装至无菌试管中，每管装量9.9ml，分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液各 0.1ml （含菌量不超过104cfu/ml）。
供试品对照组：取制备好的1:10、1:20、1:50 供试液分装中无菌试管中，每管装量9.9ml，加PH7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液0.1ml。
回收率：取上述试验组、菌液组、供试品对照组1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml 温 度 不 超 过 45℃ 的TSA/SDA，混匀，凝固，倒置培养。TSA：33℃培养3 天；SDA：23℃培养5 天，计数。供试品回收率=（试验组菌落数- 供试品对照组菌落数）/菌液组对照数。供试品需进行3 次独立平行试验。
2.3.2 中和法
试验组：分别将400 万（800 万、1200 万）单位β- 内酰胺酶加至1:10、1:20、1:50 供试液中。将1:10、1:20、1:50 经中和的供试液分装至无菌试管中，每管装量9.9ml，分别加入试验菌各0.1ml（含菌量不超过104cfu/ml）。
菌液组：分别将400 万（800 万、1200 万）单位β- 内酰胺酶加于9.9ml 的PH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液中，分别加入试验菌各0.1ml（含菌量不超过104cfu/ml）。
供试品对照组：分别将400 万（800 万、1200 万）单位β- 内酰胺酶加于1:10、1:20、1:50 供试液中，每管装量9.9ml，加PH7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液0.1ml。
回收率：取上述试验组、菌液组、供试品对照组1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml 温度不超过45℃的TSA，混匀，凝固，倒置培养，33℃培养3 天，计数。供试品回收率=（试验组菌落数- 供试品对照组菌落数）/菌液组对照数。供试品需进行3 次独立平行试验。
表1 平皿法进行微生物计数方法适用性的回收率
表2 中和法进行微生物计数方法适用性的回收率
3 试验结果分析
阿莫西林胶囊采用平皿法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验，发现金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率为0，即金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌无法通过平皿法回收。铜绿假单胞菌在1:20 供试液下的回收率在0.5～2范围内，即铜绿假单胞菌可采用平皿法（1:20 供试液）收回。霉菌和酵母菌在1:10 供试液下的回收率在0.5～2 范围内，即霉菌和酵母菌可采用平皿法（1:10 供试液）收回。详见表1。
阿莫西林胶囊采用中和法进行金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌计数方法适用性试验，发现金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在1:10 供试液加1200 单位的β- 内酰胺酶、1:20供试液加1200 单位的β- 内酰胺酶、1:50 供试液加400 单位的β- 内酰胺酶、1:50 供试液加800 单位的β- 内酰胺酶的回收率均不在在0.5～2 范围内，无法回收。发现金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在1:50 供试液加1200 单位的β- 内酰胺酶的回收率在0.5～2 范围内，即金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌可采用稀释法（1:50 供试液）和中和法加1200 单位的β- 内酰胺酶回收。详见表2。
3.1 平皿法回收率
由表1 可知，霉菌和酵母菌总数计数可直接采用平皿法（1:10 供试液）。需氧菌总数计数（铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉）通过平皿法可以回收。
3.2 中和法回收率
由表2 可知需氧菌总数（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）计数，可采用中和法（1:50 供试液+1200 万单位的β- 内酰胺酶）回收。结合表1 可知，需氧菌总数（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉）可采用稀释法、中和法联合使用，即1:50 供试液中，加1200 万单位的β- 内酰胺酶回收。
4 结论
作为药品微生物限度检查的一种方法，微生物计数法应确保其可靠性，具体验证方法可参考2015 年版《中国药典》。通过对最终产品的微生物计数，从而判别其检出结果是否符合相关国家标准或行业标准的要求以及企业产品质量要求。检验结果符合要求也能为药品的出厂放行，提供微生物负载定量证据。
阿莫西林胶囊属于β- 内酰胺酶类抗生素，本身会对部分细菌产生杀灭作用，也会使得部分致病菌处于损伤状态或在检验培养体系中抑制致病菌的活性，但在适宜的条件下，这类被抑制的微生物可能会“复活”。如果这类被损伤的致病菌进入人体，它们可能会在血液中修补损伤从而恢复活性，“复活”后的致病菌会在血液中大量繁殖，从而危害人体健康。
微生物计数方法适用性试验不仅是2015 版《中国药典》的要求，更是确保企业微生物计数方法的可靠性，保证药品中的微生物能够被检出，不会因为抑菌作用出现“假阴性”的可能性。
综上所述，对阿莫西林胶囊这种β- 内酰胺类抗生素联合使用稀释法、中和法，即在1:50 供试液中加1200 万单位的β-内酰胺酶回收需氧菌。采用平皿法，即1:10 供试液，直接回收霉菌和酵母菌。
