王 博 曹向英 孙文梅 张 婧 黄 忠 施蔡培
（1、上海市兽药饲料检测所,上海201103 2、上海市松江区食用农产品安全监督检测中心，上海201611 3、上海市嘉定区农产品检测中心, 上海201800 4、上海市崇明区动物疫病预防控制中心,上海202150)
磺胺类药物是一类人工合成的抗生素，因其抗菌谱较广、性质稳定、价格便宜等原因被广泛应用于养殖业，但是通过动物体内残留转移到人体可能会引起过敏、中毒和导致耐药性细菌的产生, 还可能引起造血系统障碍等问题[1,2]。我国农业部168号公告[3]中规定磺胺二甲嘧啶为允许用于防治动物疾病，但仅是通过混饲给药使用，且规定其休药期为15 天。通过对猪屠宰前尿液检测，能判断养殖场或养殖户是否按规定执行休药期，这对于食品安全来说是非常有必要的。而随着农业农村部194号公告[4]的发布，促生长类抗生素不得使用，规范、绿色、健康化养殖是畜牧业发展的大趋势，因此，对于非法添加的监控措施愈发显得重要。
目前国内外检测磺胺的方法多为液相色谱- 串联质谱法[5,6]，其因检测时间短、检测限低、结果准确、能大批量处理样品而被广泛应用，但缺点是仪器成本高，难以满足养殖业现场检测和推广使用，因此就需要一种快速、准确、方便、易于推广的筛查方法。Elisa 快速检测试剂盒是一种比较适合快筛的工具[7,8]，其使用基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，方法快速、准确，和质谱相比，快速检测试剂盒成本低、易携带，能满足实际检测需求，更适合推广。目前，市面上针对猪尿中磺胺类残留的检测试剂盒有多种，但是对于试剂盒实际检测效果的评价却没有，这对于不同地区对猪尿中磺胺类药物残留监管是不利的，本文通过考察常见的3 种市售磺胺检测试剂盒，对3 种试剂盒的各方面效能进行比较，挑选出最为适合日常检测磺胺的检测试剂盒，为各地加强监管提供参考。本文暂将3 种试剂盒编为试剂盒1，试剂盒2，试剂盒3，其中试剂盒2 为深圳市绿诗源生物技术有限公司生产的磺胺多残留快速检测试剂盒。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器。BioTek 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；BOD-10 低温恒温培养箱，赛默飞世尔科技(中国) 有限公司；Allegra X-22R 高速冷冻离心机，德国BECKMAN 公司；N-EVAP 水浴控温氮吹仪，上海安谱公司。
1.1.2 试剂与材料磺胺二甲 (基) 嘧啶标准品，批号:40730，99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺氯哒嗪标准品，批号: 20620，100.0%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺间甲氧嘧啶标准品，批号: 40425，98.0%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺嘧啶标准品，批号: 31010，99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；磷酸氢二钠，批号：20130719，99.0%，上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，批号：F20030220，99.5%，中国医药（集团）上海化学试剂有限公司；氯化钠，批号：20140712，99.5%，上海凌峰化学试剂有限公司。
1.1.3 主要试液配制磷酸盐缓冲液：准确称取磷酸氢二钠0.77g、磷酸二氢钾0.18g 和氯化钠8.94g，用1000mL 超纯水定容混匀，即制得磷酸盐缓冲液。
1.2 前处理方法试剂盒1，试剂盒2：将样品离心后，直接取50μL 进行检测。试剂盒3：将样品均质，取1mL 至试管中，加5mL 乙酸乙酯，混匀后上下颠倒15 分钟，离心，取1mL 上清液至试管中，50℃条件下氮气吹干，使用1mL 磷酸缓冲液复溶，吸取100μL 复溶物至试管中，加入300μL 磷酸盐缓冲液，取50μL 进行检测。
1.3 检测方法按照仪器及试剂盒说明书，用配套校准品对试剂盒进行定标，并按照说明书方法对已处理好的样品进行后续实验。
2 结果与分析
2.1 标准曲线标准曲线由6 ～7 个浓度组成，重复点样2次，按4 参数法进行计算，以吸光度为横坐标，样品浓度为纵坐标绘制标准曲线，结果见表1，三种试剂盒均表现出良好的线性相关性。
2.2 试剂盒灵敏度试剂盒的检测灵敏度以标准曲线重复测定的50%抑制浓度IC50来表示，见表2，一般来说，IC50数值越小说明抗体的特异性能越强，如表2 所示，试剂盒3 抗体的特异性能最强，因猪尿中磺胺残留限量并无相关标准作出规定，故参考GB 31650-2019 食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量中规定：所有食品动物（产蛋期禁用）各靶组织中的最大残留限量为100 μg/kg，因此，三种试剂盒均能满足实际检测需求。
2.3 回收率测定实验选择较为常见的磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺嘧啶作为磺胺类混标，通过向空白样品中添加低中高三个不同浓度的磺胺类混标来考察试剂盒的准确性，每个浓度样品重复5 次。因试剂盒1 标准曲线范围为0～40.5μg/L，因此试剂盒1 采取10、25 和40μg/L 三个浓度添加；试剂盒2 和3 则采用10、40 和100μg/L 三个浓度添加。阴性尿样采自于上海市某猪场，经LC-MS/MS 检测无磺胺残留，添加回收的检测数据见表3，如表所示，试剂盒2 的回收率为88.2～125.1%，另外两种试剂盒回收率分别为59.5～71.4%和56.4～73.1%，这可能是三种试剂盒对不同类磺胺的选择性不同，结果表明，试剂盒2 对目标磺胺类检测结果更准确。
表1 三种试剂盒线性范围、标准曲线和线性相关
表2 三种试剂盒的IC50 值（μg/L）
表3 三种试剂盒添加回收率实验（n=5）
2.4 实际样品检测与确证实验选取上海市某猪厂采集的20批猪尿样品，用三种试剂盒进行筛查，并对采集来的样品用质谱进行检测，结果显示，样品中均未检测出磺胺。
2.5 操作步骤便捷程度此次实验针对猪尿液中磺胺进行检测，三种试剂盒均采用一步竞争法，其检测过程都包含了一步竞争反应和一步显色反应，但在具体操作上还是具有较大差别，其中试剂盒1 加样4 次，孵育10 分钟，显色10 分钟；试剂盒2 加样5 次，孵育30 分钟，显色15 分钟；两类试剂盒规定样品澄清均可直接加样，操作简便；试剂盒3 加样4 次，孵育1 小时，显色30 分钟，样品前处理复杂，操作耗时耗力。
3 结论
本实验对市售的三种磺胺检测试剂盒进行评价，通过对试剂盒标准曲线、灵敏度、回收率、实际样品的检测和操作步骤的便捷程度进行考察，结果表明，试剂盒2，即深圳市绿诗源生物技术有限公司生产的磺胺多残留快速检测试剂盒标准曲线、回收率和操作步骤明显要好于另外两种试剂盒，灵敏度也能满足实际检测需求，实际操作过程中，前处理简单，能有效避免因操作不当带来的误差，因此，推荐其作为猪尿中磺胺残留检测的快筛试剂盒。
