赵世鹏 张雪萍 王相辉
(潍坊众诚司法鉴定所，山东 潍坊 261000)
1 法医物证鉴定
1.1 法医物证鉴定技术
法医物证鉴定是指鉴定人运用法医物证学的科学技术或者专门知识，对各类生物检材进行鉴别和判断并提供鉴定意见的活动。法医物证鉴定技术发展迅速，不仅能够在侦查中提供侦查线索，而且能在法院审判过程中作为判决依据,在司法领域被广泛应用，在司法实践中发挥着前所未有的重要作用。
基因测序是法医物证鉴定的核心技术。从1977 年的第一代Sanger 测序技术发展至今，基因测序已经有40 年的发展历史。1987 年，基于Sanger 测序原理Applied Biosciences 公司发布第一台自动测序仪，第一代测序读长长，准确率高，后来成为人类基因组计划的主力机型，现在依然是测序的金标准。第一代测序虽然准确度高，但是存在成本大、通量低等缺点，制约其广泛应用。经过改进，以罗氏454、illumina、Life 的Solid 系统为主的第二代测序技术出现，促使测序成本以超摩尔定律下降，测序速度大幅提高。第三代测序技术是单分子测序，由于不需要对样本进行扩增等前期准备工作，测序时间大幅缩小，理论准确性将提高，成本进一步下降，相比于二代测序技术优势明显，但是由于准确性低、测序信号易丢失等问题，目前尚在科研阶段。
二代基因测序仪是目前法医物证鉴定中使用的主要设备，其应用的主要技术为毛细管凝胶电泳与荧光检测[1]。
电泳的定义：利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。传统电泳(琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等)通常需要制胶、上样、分离、染色/脱色等操作，过程冗长，不适合定量分析，而且在电泳分离过程中，焦耳热的产生使电解质溶液的密度发生变化，导致分离度下降。1983，Hjerten将聚丙烯酰胺凝胶电泳移植，制成了毛细管凝胶电泳(CGE)，使得DNA 片段分离在毛细管电泳中成为可能。随后高效毛细管电泳技术应运而生，高效毛细管电泳是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，以样品的电荷、大小、形状等多种特性为根据的分离技术。
荧光检测原理：荧光是染料分子并检测染料被激发后产生的光，能够发射荧光的分子叫荧光基团，是具有不同形状、大小和发光能力的分子。用于DNA 标记的荧光基团发射光的波长一般在400－600nm 的范围内。荧光的发光过程分三步，首先激发光源发出一个光子将荧光基团从基态激发到激发态，然后该荧光基团构象变化及与环境作用后进入单一激发态，最后激发态的电子发出一个能量较低的光子并回到基态。吸收光谱与发射光谱峰的顶点之间产生一个差值称为司多克斯迁移。使用光谱过滤将激发光和发射光区别开，并且通过发射光谱的区别可以选择不同的荧光基团，这种特性的存在使利用多种荧光基团同时检测不同的DNA 分子称为可能。荧光基团发光效率会受到摩尔消光系数、量子产率、光稳定性、染料环境的综合作用影响。激光轰击荧光基团，荧光基团吸收激光能量，然后发出较低能量(较大波长)的光，用滤光片仅收集特定波长或波长范围的发射光，用电偶合装置收集和放大来自荧光基团的信号，并把它转换成电信号。用相对荧光强度单位计量信号，生成毛细管电泳图。不同荧光染料发射光谱的不同，不同位点的引物用不同的荧光基团标记，使不同位点的扩增产物带有不同的荧光标记，检测仪器发射特定波长激光，激发荧光分子使其发射特定波长范围的光，仪器收集该发射荧光，并将光信号转化为电信号，再转化为数字信号，收集软件将信号以扫描峰的形式显现出来。[2]
1.2 光谱校正的原理(图1-2)
图1
在ABI310 上最初称谓是Matrix 校正，在多毛细管系统上称为光谱校正。光谱校正主要是解决光谱空间到染料空间的映射问题。不同的荧光染料其发射光谱一般会部分重叠，也可以说光谱校正就是修正不同染料发射光谱之间叠加的一个数学矩阵。多色荧光检测需要检测四到五种荧光分子在其中心发射波长处的信号。由于每种荧光分子的发射光谱不是锐线光谱，而是有一定宽度分布的光谱带，所以一种纯荧光分子除在它自己的中心波长处能采集到信号外，在其他荧光分子的中心波长处也能检测到信号，导致信号重叠。为了消除这些重叠的信号，需要知道每种荧光信号在其他荧光信号处的重叠系数。所以，用分别标记有不同荧光分子的四(或五)条不同长度的DNA 片断(即光谱校正标准品)来测定这些系数，得到一个4×4(或5×5)的矩阵。进行样品检测时，软件会自动将收集到的样品数据与光谱进行比较；通过比较，每个色道其他染料产生的信号将被扣除，因此补偿了光谱间的叠加。[3]通过分析光谱校正的标准品，数据收集软件利用数学矩阵进行计算，使每一种被校准的染料在多通道毛细管测序仪上呈现单一峰形。
图2
2 光谱校正的实际应用
2.1 测序仪何时需进行光谱校正(图3)
图3 基线不平，需进行光谱校正
建立与荧光染料相适应的光谱校正，能够防止发生相邻染料通路之间的渗透，STR 试剂盒生产商都会提供与试剂盒标记引物荧光染料相同的特定DNA 样本作为标准品。不同的STR 试剂盒有不同的染料组合，在测序时，相应的STR 试剂盒必须用与之相匹配的染料组合进行光谱校正，否则将不能正常的收集数据。染料标记的DNA 分子数量过多时，饱和的CCD 检测信号也会产生拔起现象。在实际操作中，遇到以下几种情况时，通常需要对仪器进行光谱校正：(1)使用新的荧光染料组合；(2)激光或CCD 被调节或更换后；(3)参数改变、更换毛细管或者调整光路后；(4)不同颜色的荧光间出现干扰(有拔起或下压峰)，检测图谱基线不平，峰形明显异常。
2.2 如何进行光谱校正操作及评价(图4)
图4 光谱校正通过
2.2.1 光谱校正步骤
2.2.1.1 按所用STR 试剂盒的说明书，准备光谱校准的标准品试剂，并创建光谱校准操作流程(Spectral Protocol)和运行模式(Spectral Run Module)。
2.2.1.2 按STR 试剂盒说明书，创建光谱校准板并运行。
2.2.1.3 评价选定毛细管的光谱图谱和原始数据。
2.2.1.4 对符合要求的光谱校准文件进行重命名并保存。
2.2.2 光谱校正的评价参数及标准
2.2.2.1 Q 值：Q 值表示得到的matrix 与理论值间一致性的参数。Q 值为1.0 表示实际matrix 与理论值完全相符，无任何pulldown 或pull－up 峰。minQ 表示对pull-up 或pull-down 峰的容忍度。默认值为0.95。进行光谱校正后，软件会自动计算得到每根毛细管的Q 值，Q 值小于minQ(0.95)时，校正失败。
2.2.2.2 C 值：表示染料组合中各染料发射光谱的染料峰的重叠程度。若染料峰间无重叠，则C 值为1.0,为最低可能值。随重叠程度增加，C 值相应增大。
2.2.2.3 确认光谱中峰的顺序从左至右为橙- 红- 黄- 绿-蓝。
2.2.2.4 查看光谱图谱中，反应板图形中通过的毛细管数量(不通过，即黄褐色的反应孔≤3 个)。确认光谱中的峰不含大范围交迭、倾斜或其它不规则现象。
3 结论
测序仪在完成初始的空间校准和光谱校正后，便可以收集数据并计算生成DNA 图谱。伴随时间迁移，光谱校正的效果也会发生变化，因此需要定期对测序仪进行光谱校正。法医物证鉴定应用越来越广泛，作为法医物证鉴定人员，应该深入了解测序仪工作原理，这样才能有针对性的解决实际工作中遇到的各种问题。光谱校正作为测序仪稳定性的重要指标之一，作为鉴定人员应该熟悉常出现的问题，以及掌握光谱校正的操作，确保能够稳定的收集到准确的实验数据。
