何明洋

摘 要：RNA沉默是一种在真核生物中广泛存在的防御机制，它的一个主要作用是抗病毒。为了阐明这个机制，很多植物病毒的功能蛋白都被用来做RNA沉默抑制子的研究。RNA III聚合酶家族的Dicer在基因沉默机制中发挥关键的作用，不同的物种含有不同数量和种类的Dicer，可以将外源的mRNA切割成21-26nt的小片段，从而阻断外源基因的翻译途径，达到基因沉默的目的。病原物在进化的过程中，编码沉默抑制子蛋白，对抗寄主的基因沉默。沉默抑制子通过与寄主的蛋白或外源RNA等互作，抑制寄主的基因沉默。关于Dicer与沉默抑制子的研究将给更好地解析基因沉默机制提供理论基础。

关键词：RNA沉默；沉默抑制子；Dicer

植物和无脊椎动物能够利用基因沉默机制可以保护他们免受病毒的攻击，RNA沉默在植物中被称为转录后基因沉默，在真菌体内被称为基因压制，在动物体内被称为RNA干涉[1]。

Dicer，是RNaseIII核酸内切酶超家族成员，其在RNA沉默过程中起着重要的作用，它在RNAi和miRNA形成的路径中是一种关键的酶，RNAi和miRNA的产生过程中是需要dicer or dicer-like，同时它也在RNA沉默的效应阶段起着重要的作用，能够和RNA诱导的沉默复合体结合[2]。在RNA沉默的机制中，Dicer能够长的双链RNA剪切为短小的、寡核苷酸数量在21-24个碱基siRNA。紧接着这些siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体中，使复合体活化，然后与靶标mRNA结合并降解它。基因组序列测定表明真核基因组中的dcl蛋白数量从人类的一种dicer到模式生物拟南芥中的四种dicer不等。哺乳动物仅仅只有一个dcl蛋白，但它确参与了两个不同途径的RNA沉默过成：siRNA和miRNA；相反，在其他生物种发现了较复杂的dcl蛋白比如果蝇、拟南芥和真菌。这些dcl蛋白被指出是在RNA沉默过程中起着比较重要的作用。鉴于这些复杂的蛋白的功能特殊性，现在很多的学者很有兴趣知道这些功能多样性的dcl蛋白在进化过程中是怎样和不同的RNA沉默的路径相关的。

植物比其他真核生物含有更多的DICER-LIKE （DCL） enzymes和双链RNA结合蛋白，能够增加小RNA的复杂性。在拟南芥中，已经报道有四种基因编码的蛋白属于DCL家族成员（DCL1到DCL4），从NCBI数据库中已报道的结论可知dcl3蛋白没有任何的双链RNA结合基序区域但是它却含有两个和双链RNA结合基序区域的序列，而dcl1已经被报道与miRNA的产生有关，最近又有分析说dcl2和dcl3和病毒的siRNA和寄主内源siRNA的合成有关。通过分析单dcl突变体，双dcl突变体，三dcl突变体和四dcl突变体的分析，只有dcl1作为一种复杂精细的酶能够产生miRNA和siRNA，而其他的三种dcls仅仅只能产生siRNA。dcl2蛋白在一定的条件下能够拮抗由dcl1蛋白产生的miRNA和siRNA的产生，在dcl1 dcl4和dcl1 dcl3 dcl4突变体中能够使植物发病，然而突变体dcl1 dcl2 dcl3 dcl4植物中，不会是植物发病。同时研究还发现病毒的siRNA是由dcl4蛋白产生的，但当dcl4得活性降低时或者其活性被病毒抑制时，dcl2在一定条件下可以取代dcl4的功能。由于植物中小RNA组分的复杂性，每个dcl蛋白的具体功能（尤其是dcl2）还不是很清楚[3]。另外，能够和特异的双链RNA结合的蛋白是和细胞的信号传导和基因表达相关的，同时还具有保守的双链RNA结合基序。

而在哺乳细胞中，例如脆性X综合症蛋白（FMRP）已经被报道是miRNA的一部分，通过利用重组蛋白的方法，我们已经证明人类的脆性X综合症蛋白可以当做miRNA的受体蛋白对于核糖核酸酶Dicer来说，同时能够和靶标RNA结合，使其降解。体内有效的RNA干涉所需要的miRNA已经被揭示了利用不同的siRNA诱导物诱导的报告基因沉默的方法[4]。在真菌体内，由于突变两种dcls基因而使dcl蛋白的活性降低的实验能够消除转基因诱导的基因沉默和使双链RNA变成siRNA的形成过程。第一个说明在转基因诱导的基因沉默中起作用的dicer蛋白是在RNA依赖性的RNA聚合酶作用下形成的双链RNA参与的沉默过程中是起着重要作用的。丝状真菌基因组中有两种DCL基因（dcl1和dcl2）应经被证实。已有报道说如果存在dcl2突变体的情况下会破坏基因沉默从而使绿色荧光蛋白的强度增强，也能够使siRNA的积累水平降低到无法检测的水平[5]。但是，如果突变其他的DCL基因例如dcl1基因，它仍然会像野生型的一样产生基因沉默也可以使siRNA积累到可以检测的水平。报道还说明当在基因沉默不充分的表型真菌和由于dcl2基因突变无法积累siRNA的真菌体内都可以通过野生型（即带有dcl2基因）真菌来使其恢复正常表型。这说明只有dcl2蛋白能够促进siRNA的形成。

而在卷枝毛霉菌中，RNA沉默能够出现不寻常的特点，比如正义链的自我复制，两种反义链siRNA的积累。研究学者为了调查这种基因沉默是不是遵循他物种基因沉默机制，他们使用发夹RNA作为基因沉默的触发器来分析在不同的基因环境下基因沉默的有效性和稳定性。结果表明，双链RNA诱导的基因沉默机制也和两种反义的siRNA的积累有关的。但是这种基因沉默的机制并不和前人研究的由dcl1基因有关，而是和另外一种基因dcl2有关，dcl2基因首先被识别和克隆，同时相应的无效突变体也由基因复制所产生。但是这种突变体在基因沉默中会被正义链自我复制或者反向重复基因所损伤，另外dcl2功能的行使也是需要两种反义siRNA 的正常积累的。除了其在基因沉默中的重要作用，dcl2也在植物发展方面起着重要的作用，因为dcl2的无效突变体能够显着减少无性孢子的产生。

植物和动物病毒由于不断地演化，能够编码产生各种RNA沉默的抑制子来抵抗寄主的抗病毒沉默，通过利用基因沉默检测的方法能够鉴别和描述沉默抑制子的活性，在接种的原生质体中沉默抑制子能够增强病毒的沉默，促进病毒在植物叶片细胞之间的短距离运动和依赖于韧皮部的长距离病毒运动，就能够造成系统侵染的组织中造成病症[6]。当植物受到病毒侵染时，不同的沉默的抑制子是怎样在沉默的不同阶段发挥作用的；沉默抑制子在抑制沉默过程中是不是起直接作用而引起发病症状，是Ding等人讨论的问题。Ding等人在烟草和拟南芥中通过“交叉保护”[7]机制来抵抗CMV的侵染。首先，在拟南芥叶片上接种不含有抑制子2b的CMV，然后一段时间后，当病毒CMV再次侵染时，拟南芥不会感病，无病害症状产生。CMV的突变体2b（CMV-△2b）引起的交叉保护不是基因沉默。我们想通过调查分析这种机制和基因沉默的发生过程是不是有关联的，因为基因沉默过程中能够编码四种DCL蛋白，其中的dcl2、dcl3和dcl4参与到抗病毒沉默的过程中。在野生型拟南芥植物中，侵染CMV-△2b是不会产生病症的，受到交叉保护的机制，当CMV-2b也侵染此拟南芥时，植株是不会感病的。CMV-△2b对抗CMV-2b所产生的交叉保护反应也可以在dcl2、dcl3或者dcl4突变体中观察到，而且在dcl2 dcl4双突变体中其反应更强烈。但是，当侵染拟南芥的CMV-△2b含量很高时，也能够使植株发病。这种结果说明CMV-△2b与CMV-2b产生的交叉保护机制并不是完全依赖于基因沉默机制，也有可能和病毒之间的竞争有关[8]。另外，研究还发现在布氏锥虫体内，基因沉默的一种保守途径是RNA干涉，RNA干涉过程中涉及到两种核糖核酸内切酶：一个是Dicer蛋白，另外一种是AGO蛋白或者是Slicer蛋白[9]。其中DCL蛋白是RnaseⅢ家族成员，它能够促使siRNA的产生，从而引起RNA干涉作用。研究还发现，Dicer和DCL蛋白在羧基端都有两个临近的区域蛋白分别称为RNase IIIa和RNase IIIb，这两种区域的出现在布氏锥虫DCL蛋白结构中是不寻常的，RNase IIIa是接近氨基端，RNase IIIb却被定位在酶分子的中心区域，基于这种结构的特性使的dcl RNaseⅢ具有活性。

参考文献

[1]Naoki Kadotani， Toshiki Murata， Nguyen Bao Quoc， Yusuke Adachi and Hitoshi Nakayashiki. Transcriptional Control and Protein Specialization Have Roles in the Functional Diversification of Two Dicer-Like Proteins in Magnaporthe oryzae. Genetics 180： 1245-1249 （October 2008）.

[2]Lukasz Jaskiewicz and Witold Filipowicz. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2008.

[3]Nicolas Bouche'， Dominique Lauressergues，Virginie Gasciolli and Herve' Vaucheret. An antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. The EMBO Journal （2006） 25：3347-3356.

[4]Isabelle Plante， Laetitia Davidovic， Dominique L. Ouellet， Lise-Andr？ee Gobeil， Sandra Tremblay， EdouardW. Khandjian， and Patrick Provost. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Volume 2006， Article ID 64347， DOI10.1155/JBB/2006/64347.

[5]Naoki Kadotani， Hitoshi Nakayashiki ， Yukio Tosa， and Shigeyuki Mayama. One of the Two Dicer-like Proteins in the Filamentous Fungi Magnaporthe oryzae Genome Is Responsible for Hairpin RNA-triggered RNA Silencing and Related Small Interfering RNA Accumulation. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 279， No. 43： 44467-44474，2004.

[6]Juan A. Diaz-Pendon， Feng Li，Wan-Xiang Li， and Shou-Wei Ding. Suppression of Antiviral Silencing by Cucumber Mosaic Virus 2b Protein in Arabidopsis Is Associated with Drastically Reduced Accumulation of Three Classes of Viral Small Interfering RNAs. The Plant Cell， Vol. 19： 2053-2063， June 2007.

[7]A. Gal-On and Y. M. Shiboleth. Cross-Protection . Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses， 261-288.

[8]Heiko Ziebell and John P. Carr. Effects of dicer-like endoribonucleases 2 and 4 on infection of Arabidopsis thaliana by cucumber mosaic virus and a mutant virus lacking the 2b counter-defence protein gene. Journal of General Virology （2009）， 90： 2288-2292.

[9]Huafang Shi， Christian Tschudi and Elisabetta Ullu. An unusual Dicer-like1 protein fuels the RNA interference pathway in Trypanosoma brucei. RNA 2006 12： 2063-2072.