丁 波，张国峰，朱逸斐
（珠海医凯电子科技有限公司，广东珠海 519041）
近年来，随着医学超声、先进材料和人工智能技术的发展，超声波在临床诊断和治疗中应用日益广泛[1-2]。当超声波在生物组织中传播时，除了波动效应外，不均匀的组织内部结构还会对声波引发复杂的声散射、声吸收和声衰减效应，并由此可以在深部组织中产生显着的热效应和机械效应。生物组织中的超声热效应主要是由部分声能被组织吸收并转化为热量引起的，可导致深部组织温度迅速升高，由此达到甲状腺或肿瘤消融等治疗目的。而医学超声相关的最关键的超声机械效应之一是一种称为声空化的过程。当声波在组织中传播时，若声压超过一定阈值强度，血液或组织液中溶解的肉眼不可见的微小气核会在超声的负声压相缓慢膨胀生成空化气泡，在超声正声压相时这些空化泡会快速塌缩甚至破裂，在空化泡生成、振荡乃至破裂的一系列动力学过程中会产生声微流、声射流甚至冲击波，并由此在微泡尺度的极小空间内瞬间释放高温高压，对组织或血管壁施加机械力学作用[3-5]。
天然环境中组织液或黏性血液中的含气量极小，相应的超声空化阈值也在数兆帕之上[6]，对其在治疗超声领域的应用造成了障碍。而超声造影剂微气泡的引入可以显着降低空化阈值，并通过充当空化核来增强空化强度，产生更强的治疗效果（如基因/药物转染、血脑屏障开放、肌骨治疗等）[6-7]。但需要指出的是，如果参数选择不恰当，导致微泡声空化强度过高时，剧烈的声空化机械效应也会导致微血管破裂、溶血和DNA 断裂[8-11]等不利影响，所有这些在临床超声诊断和治疗中通常都是希望尽量避免发生的副作用。换言之，在临床应用中，希望可以选择恰当的微泡和超声作用参数，在利用超声造影剂微泡产生有效的声空化治疗效果的同时，尽力避免过强的声空化作用对病灶周围的正常组织产生过度损伤等副作用。
在前期工作中，对超声热效应做了大量研究工作，发现组织损伤的程度取决于温度的升高，而更高的温度可通过提高声压、超声中心频率或延长超声辐照时间来实现。然而，关于微泡声空化相关的影响因素的研究尚不明确，但前人的研究已经提示了超声造影剂微泡的声散射和声空化特性（如空化阈值和空化强度等）及其引发的生物效应微泡的物理特性（如粒径、浓度等）特征和相关声学作用参数（如声压、脉冲宽度、脉冲重复频率和作用时间等）紧密相关。因此，在本研究中，聚焦于2 种已经获得临床应用批准的商用超声造影剂微泡（Optison 和SonoVue），针对其空化阈值与微泡浓度和超声脉冲宽度之间的关系开展了系统研究。
1 实验设计
1.1 实验材料
本研究中采用的2 种超声造影剂Optison（GE Health Care，美国）和SonoVue（Bracco，意大利）都是已经获得国际批准的临床常用造影剂微泡。其中，Optison 是由蛋白单层膜包裹氟化碳（C3F8）气核形成的微气泡，平均半径约为2.0 μm。而SonoVue 则是由单层磷脂包裹六氟化硫（SF6）气核形成的微气泡，平均半径同样约为2.0 μm。根据制造商的建议，在实验前准备过程中，将轻轻摇晃未打开的OptisonR小瓶以均匀混合其内容物，在用注射器从试剂瓶中取出微泡样品之前，先用无菌的18 号针头对试剂瓶进行通气，随后用另一支18 号针头将不同体积的Optison 微泡溶液提取到注射器，利用生理盐水将微泡悬浮液稀释成初始浓度约为2～5×108个/mL 微泡溶液待用。对于SonoVue微泡，则首先用无菌的18 号针头对试剂瓶进行通气，然后按照制造商建议向试剂瓶中注入5 mL 生理盐水对微泡进行初步稀释后以待后续实验，此时微泡浓度根据制造商数据应约为5～8×108个/mL。实验前，经Malvern 颗粒尺寸分析仪（Mastersizer 2000，Malvern Instruments 有限公司，Worcestershire，UK）测量Optison和SonoVue 微泡的平均直径分别约为2.2±0.3 μm 和1.9±0.2 μm。
1.2 实验材料
如图1 所示，所有实验都是在充满脱气水的亚克力水槽中进行的，用于信号激励的1.1 MHz 单阵元聚焦换能器与用于空化信号接收的5 MHz 单阵元平面换能器（Sonic Concepts，Woodinville，美国）正交固定在水槽的2 个相邻侧壁上。将吸声橡胶放置在与聚焦转换器相对的水槽端壁上，以最大限度地减少声反射对实验测量结果的影响。在超声激励系统中由信号发生器（33120A，Hewlett Packard，美国）提供驱动信号，经50 dB 功率放大器（A-150，ENI，美国）放大后驱动1.1 MHz 聚焦换能器来激励造影剂微泡产生超声空化活动。而5 MHz 平面换能器（直径为1.2 cm）则被用于被动采集微泡声空化行为产生的声散射信号，所采集的信号数据随后通过数字示波器 （LC 334AM，Lecroy，美国）显示后存储于电脑中用于后续数据分析。整套实验系统由LabView 软件（National Instruments，美国）控制运行。
图1 实验系统示意图
1.3 实验设计
造影剂微泡空化行为产生的声散射信息经由以5 MHz 平面换能器为主的被动空化探测系统监测后，其空化阈值可通过对散射信号进行快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform，FFT）后获得的特征频谱加以量化定征[12]。简言之，对于每个样本产生的空化散射信号采集1 000 个波形序列，采样率为25 MHz，单个波形采样时间为200 μs。对每个信号做FFT 后取其平均谱。如图2 所示，以声压为0.05 MPa 的声信号激励下的生理盐水中采集到的散射信号谱（细虚线）的FFT 平均值为参考底线，而微泡样品的空化声压阈值则被定义为其FFT 谱线平均强度高于参考底线10%（如图2 中针对特定浓度Optison 样品在0.18 MPa 驱动声压下测量所得的粗实线所示）。
图2 由空化微泡声散射频率确定其空化阈值
本研究中主要针对2 种超声造影剂微泡开展了系列实验。
1）超声脉冲宽度对微泡空化阈值的影响：采用4个不同超声脉冲宽度（2、5、10 或20 周期）来研究特定不同浓度条件下造影剂微泡的空化阈值。对于不同的脉冲宽度，可通过调整脉冲重复频率PRF 来确保超声辐照总时间保持不变（即脉冲长度分别为2、5、10 或20 个周期时，PRF 从500、200、100 变化至50 Hz）。超声驱动声压幅度则由0.05 MPa 逐步提升至0.5 MPa。对于每个参数条件下的微泡样本进行3 次重复测量。
2）微泡浓度对其空化阈值的影响：在一定的脉冲长度和PRF 下，针对不同浓度的造影剂微泡样品（体积比为0.1%、0.5%、1%、2.5%或5%）测量其空化声压阈值。超声驱动声压幅度则由0.05 MPa 逐步提升至0.5 MPa。对于每个参数条件下的微泡样本进行3 次重复测量。
2 结果
2.1 Optison 微泡的空化声压阈值
图3显示了Optison 造影剂微泡在不同体积浓度和超声脉冲宽度条件下测得的空化声压阈值。由图3可知，对于特定体积比的Optison 微泡，其空化阈值将随着激励超声脉冲宽度的增加而降低，例如微泡体积比为1%时，若脉冲宽度从2 个周期增长到20 个周期时，其空化声压阈值从大约0.17 MPa 下降到约0.1 MPa。同时，在特定脉冲宽度条件下，高浓度微泡将具有更低的空化阈值。但也要注意到，当微泡体积浓度大于2.5%时，其空化声压阈值受脉冲宽度的影响将变低。
图3 Optison 造影剂微泡的空化声压阈值测量结果
2.2 SonoVue 微泡的空化声压阈值
图4则显示了SonoVue 造影剂微泡在不同体积浓度和超声脉冲宽度条件下测得的空化声压阈值。由图4 可知，总体而言，SonoVue 微泡的空化声压阈值略小于Optison 微泡。对于特定体积比的SonoVue 微泡，类似于Optison 微泡，其空化阈值将随着激励超声脉冲宽度的增加而下降。但对于特定脉冲宽度的激励信号，SonoVue 微泡的空化阈值随其体积比的变化较小，尤其是当脉冲宽度大于10 个周期时，不同浓度的SonoVue 微泡的空化声压阈值几乎趋近一定的稳定值（约0.8～1.0 MPa）。
图4 SonoVue 造影剂微泡的空化声压阈值测量结果
3 讨论
本研究针对2 种商用超声造影剂微泡，研究其空化声压阈值随微泡体积比浓度和激励超声脉冲宽度的变化情况。总体而言，2 种微泡的空化声压阈值将随其体积比浓度或激励超声脉冲宽度的增加而下降。这是因为体积比浓度较大的微泡溶液中含有更多的空化气核，而激励超声脉冲宽度增加则对应于驱动声能量的提高，由此导致微泡空化行为更容易发生。
可以理解的是，对于一定体积比浓度条件下的超声造影剂微泡溶液，其空化声压阈值将随着激励超声脉冲宽度的增加而减小。应注意到，由于激励信号源需要一定的起振时间来稳定其输出波形，因此，对于短脉冲信号（例如2 或5 个周期），焦点处输出波形的实际振幅常常小于长脉冲信号（如10 或20 个周期）获得的稳定振幅。因此，短脉冲信号可能不足以在较短时间内向微泡溶液中输运足够的声能量来促使微泡产生强烈的空化行为。
同时要注意到，与Optison 微泡相比，SonoVue 微泡的空化声压阈值相对较小，且随其体积比浓度的变化幅度更小。这是因为Optison 微泡采用蛋白包膜，而SonoVue 微泡则采用厚度更小、硬度更低的单层磷脂包膜，且在特定体积比浓度下，单位体积中含有的SonoVue 微泡的实际数目稍高于Optison 微泡（根据制造商数据，SonoVue 微泡初始浓度为5～8×108个/mL，而Optison 微泡的初始浓度为2～5×108个/mL），因此更容易被低强度的超声信号激发，由此产生较低的空化阈值和更稳定的空化行为。实际上，前人的研究结果也表明，外壳较薄的造影剂微泡将具有较低的空化声压阈值[5]，本研究的观测结果验证了前人的实验观察。
4 结论
本文的研究结果说明了超声造影剂微泡的空化声压阈值将同时受到微泡性质（如浓度）和驱动超声特性（如脉冲宽度）的影响。总体而言，与前人的观察结果类似，具有较薄外壳的SonoVue 微泡具有更低的空化阈值，而且微泡的空化阈值可以通过增加空化气核（如提高微泡体积比浓度）或增强单位时间内的激励超声能量（如增加超声脉冲宽度）来实现。因此，在实际应用中，选择更为恰当的造影剂微泡或超声激励参数来调控微泡空化阈值和强度，满足特定的诊疗需求。
