方洁，朱建坡，张虎，吕志峰#，张淑香
河南中医药大学第一附属医院1麻醉科，2血液肿瘤科，郑州 450000
膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤之一，发病率逐 年上升[1]。恶性肿瘤的发生发展与抑癌基因失活、原癌基因激活等密切相关，如何激活已经失活的抑癌基因，使其重新获得活性已成为抗肿瘤基因治疗的热点。肌成束蛋白1（fascin 1，FSCN1）最早于海胆的卵母细胞质中被发现，属于肌动蛋白结合蛋白家族成员，在人体正常组织中的表达水平相对较少，而在多种恶性肿瘤组织中表达上调[2-3]。研究显示，抑制FSCN1的表达可降低乳腺癌细胞的增殖能力[4]，miRNA-145可靶向抑制FSCN1的表达，从而抑制前列腺癌和胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力[5-6]。研究发现，抑制FSCN1的表达可抑制膀胱癌细胞的增殖能力[7]，但FSCN1对膀胱癌细胞凋亡的影响及具体的作用机制尚未明确。普鲁卡因是一种较为安全的局部麻醉药物，研究表明，普鲁卡因可抑制膀胱癌、鼻咽癌等肿瘤细胞的生长[8-9]。若FSCN1基因可增加普鲁卡因对膀胱癌细胞的生长抑制作用，这将明显有助于膀胱癌的治疗。信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）可参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，并在多种肿瘤细胞中异常激活，磷酸化STAT3（phospho-STAT3，p-STAT3）也与肿瘤细胞的转移和侵袭密切相关[10]。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）是调控细胞周期G1期的关键蛋白，在膀胱癌中过表达，参与膀胱癌细胞的侵袭和转移过程[11]。Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）是促凋亡因子，其表达情况可间接反映细胞的凋亡情况。本研究通过干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制膀胱癌细胞FSCN1基因的表达，探讨FSCN1siRNA联合普鲁卡因对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响及作用机制，以期为膀胱癌的治疗提供理论基础，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器
人膀胱癌T24细胞购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。RPMI 1640培养液、胎牛血清均购自美国GIBCO公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）溶液购自美国Sigma公司，膜联蛋白V（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国CST公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗购自美国Thermo Scientific公司，酶标仪购自美国BIO-RAD公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及转染采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基常规培养人膀胱癌T24细胞，置于37℃、5%CO2培养箱培养。取对数生长期的细胞，以5×105/ml的浓度接种于6孔板。当细胞融合度为70%时，将阴性对照的siRNA和FSCN1siRNA分别转染至人膀胱癌T24细胞，分别作为NC组和si-FSCN1组，将仅加入LipofectamineTM2000的T24细胞作为对照组，补加培养液至2 ml，转染体积为100 pmol，转染5～6 h，更换为含血清及青霉素和链霉素的培养基继续培养48 h。
1.2.2 细胞处理及分组取转染后的NC组、si-FSCN1组T24细胞，分别向其中加入4 mmol/L的普鲁卡因处理48 h，分别作为普鲁卡因组和普鲁卡因+si-FSCN1组；未加入普鲁卡因的对照组T24细胞不进行特殊处理。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期分布情况取对照组、si-FSCN1组、普鲁卡因组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞，预冷后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗，400 μl的1×结合缓冲液（binding buffer）重悬细胞（约含有 1×106个细胞），缓慢加入1 ml的70%预冷乙醇，于4℃冰箱中固定过夜，PBS冲洗，加入含有100 μg/ml的PI染色液，避光反应30 min，流式细胞仪检测各组细胞的周期分布情况。实验重复3次。
1.2.4 MTT 法检测细胞增殖能力取对照组、si-FSCN1组、普鲁卡因组和普鲁卡因+si-FSCN1组T24细胞，以每孔4×103/ml的浓度接种于96孔板，每孔 100 μl，常规培养 24 h，每孔加入 5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培养4 h后加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）100 μl，振荡混匀 10 min，酶标仪测定570 nm处的吸光度（A）值。实验重复3次。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取对照组、si-FSCN1组、普鲁卡因组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞，预冷后 PBS 洗涤细胞，400 μl的 1×binding buffer重悬细胞（约含有1×106个细胞），分别加入5 μl和 10 μl的 Annexin V-FITC/PI溶液，避光孵育 15～20 min，1 h内采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况，检测前加入 1×binding buffer溶液 300 μl。实验重复3次。
1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX 蛋白的相对表达量裂解液提取对照组、NC组、si-FSCN1组、普鲁卡因组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞的总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。取30 μg的变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，洗膜后采用5%的脱脂奶粉室温封闭，4℃摇床孵 育 一 抗（1∶1000稀 释 的 FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX 及内参 GAPDH 抗体）过夜，洗膜，加入HRP标记的二抗（1∶2000），37℃孵育 1.5 h，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液显色、定影。Quantity软件分析各蛋白条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH蛋白灰度值比值作为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FSCN1蛋白相对表达量的比较
转染后，si-FSCN1组T24细胞FSCN1蛋白的相对表达量为（0.09±0.01），明显低于对照组的（0.36±0.04）和NC组的（0.37±0.04），差异均有统计学意义（t=10.671、10.633，P＜0.01）；且NC组和对照组细胞FSCN1蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 细胞周期分布情况的比较
普鲁卡因组、si-FSCN1组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞G0/G1期细胞比例均高于对照组细胞，G2/M期、S期细胞比例均低于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且普鲁卡因+si-FSCN1组细胞G0/G1期细胞比例高于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，G2/M期及S期细胞比例均低于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）
表1 4组细胞周期分布情况的比较（±s）
表1 4组细胞周期分布情况的比较（±s）
注：a与对照组比较，P<0.05；b与普鲁卡因组比较，P<0.05；c与si-FSCN1组比较，P<0.05
组别G0/G1期G2/M期S期对照组55.06±1.6528.23±0.8516.71±0.42普鲁卡因组67.49±1.78a22.33±0.77a10.18±0.35a si-FSCN1组65.35±1.51a23.45±0.81a11.20±0.38a普鲁卡因+si-FSCN1组77.21±2.01a b c16.52±0.53a b c6.27±0.27a b c F值81.134123.343431.282 P值0.0000.0000.000
2.3 细胞增殖能力和细胞凋亡率的比较
普鲁卡因组、si-FSCN1组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞A值均低于对照组细胞，细胞凋亡率均高于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且普鲁卡因+si-FSCN1组细胞A值低于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，细胞凋亡率高于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）
表2 4组细胞增殖能力和细胞凋亡率的比较（±s）
表2 4组细胞增殖能力和细胞凋亡率的比较（±s）
注：a与对照组比较，P<0.05；b与普鲁卡因组比较，P<0.05；c与si-FSCN1组比较，P<0.05
组别A值 凋亡率（%）对照组0.84±0.073.46±0.32普鲁卡因组0.52±0.05a26.37±2.02a si-FSCN1组0.58±0.05a19.18±1.63a普鲁卡因+si-FSCN1组0.31±0.03a b c38.81±3.16a b c F值54.228155.325 P值0.0000.000
2.4 STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白的相对表达量的比较
Western blot检测结果显示，普鲁卡因组、si-FSCN1组和普鲁卡因+si-FSCN1组细胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相对表达量均低于对照组细胞，BAX蛋白的相对表达量均高于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；普鲁卡因+si-FSCN1组细胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相对表达量均低于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，BAX蛋白的相对表达量均高于普鲁卡因组和si-FSCN1组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。4组细胞STAT3蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3）
表3 4组细胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相对表达量的比较（±s）
表3 4组细胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相对表达量的比较（±s）
注：a与对照组比较，P<0.05；b与普鲁卡因组比较，P<0.05；c与si-FSCN1组比较，P<0.05
组别STAT3p-STAT3cyclin D1BAX对照组0.77±0.070.20±0.020.49±0.050.11±0.01普鲁卡因组0.75±0.070.09±0.01a0.17±0.02a0.16±0.02a si-FSCN1组0.75±0.070.11±0.01a0.24±0.03a b0.16±0.02a普鲁卡因+si-0.76±0.070.04±0.01a b c0.07±0.01a b c0.41±0.04a b c FSCN1组F值0.05690.36399.683109.741 P值0.9820.0000.0000.000
3 讨论
FSCN1是一种细胞骨架蛋白，可与F肌动蛋白交联从而调节细胞膜片状伪足、丝状伪足及微棘的形成，影响肿瘤细胞的侵袭和迁移[12]。研究显示，除肺癌和肝癌外，FSCN1蛋白在大部分上皮肿瘤组织中表达水平较高，且明显高于正常组织[13]，表明FSCN1在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。但也有研究表明，抑制FSCN1的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖能力[14]。研究显示，FSCN1在膀胱癌患者膀胱组织中表达水平较高，且与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关[15]，抑制FSCN1的表达可抑制膀胱癌细胞的增殖能力[7]。因此，本研究旨在探讨抑制FSCN1的表达对膀胱癌细胞的影响。
RNA干扰是一种新的基因阻断技术，可在转录后抑制相关基因的表达水平，因其对相关基因的抑制作用与基因敲除类似，且具有高特异性和高效性的优势，目前已广泛地应用于基因功能研究和肿瘤的治疗中[16-17]。本研究结果显示，si-FSCN1组细胞A值降低，凋亡率升高，且细胞被阻滞在G0/G1期。普鲁卡因是一种常用的局部麻醉药物，临床主要用于支气管哮喘和老年慢性病等的治疗，研究发现，普鲁卡因可用于抗肿瘤治疗，可抑制包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤细胞的生长[8]。抑制FSCN1基因的表达联合普鲁卡因治疗膀胱癌成为临床研究的热点。本研究结果发现，普鲁卡因联合FSCN1siRNA抑制膀胱癌细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用比FSCN1siRNA或普鲁卡因单独使用的效果更加明显，表明FSCN1siRNA联合普鲁卡因治疗膀胱癌可产生协同作用。
STAT3是是一类重要的转录因子，在多种恶性肿瘤细胞和肿瘤组织中表达异常，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、免疫逃逸等行为密切相关，STAT3的持续激活可引起细胞的增殖异常和恶性转化[18-20]。但STAT3并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过对一些与肿瘤增殖、凋亡等相关因子表达的调控影响肿瘤的发生发展。cyclin D1是STAT3信号下游的靶基因，作为细胞周期核心因子，可使肿瘤细胞由G1期向S期转变，在包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤中异常表达，具有促进肿瘤细胞增殖的作用[21-22]。BAX是B细胞淋巴瘤/白血病-2家族成员，具有促进细胞凋亡的作用，可调控多种恶性肿瘤细胞的凋亡过程[23-24]。本研究结果显示，FSCN1siRNA或普鲁卡因均可抑制p-STAT3、cyclin D1蛋白的表达，上调BAX蛋白的表达，且二者联合的调控作用更明显，表明FSCN1siRNA和普鲁卡因均可通过下调STAT3信号通路的表达抑制膀胱癌细胞的生长。
综上所述，普鲁卡因或FSCN1均可抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期，且可能通过STAT3信号通路发挥协同作用。
