高效液相色谱法测定通塞益脑口服液中α-细辛醚和β-细辛醚的含量

乔立业 岩林苹 汪 玥 贾 佳 苏 华 任海祥

南京军区南京总医院制剂科，南京 210002

通塞益脑口服液是南京军区南京总医院（以下简称“我院”）的院内制剂，能够活血通络，豁痰开窍，是由石菖蒲、地龙、川芎、延胡索、泽泻和鸡血藤共6味药材组成的复方制剂，用于治疗脑梗死所致的偏瘫无力、口眼歪斜、记忆力减退等[1]，经我院多年临床研究，显示其疗效突出。该方中川芎为君药，行气活血；臣药石菖蒲能够化湿和胃、开窍豁痰、醒神益智[2]，与川芎配伍，增强了其行气开郁的作用。石菖蒲中有效成分挥发油的地位颇为重要，通过对该药的挥发油进行GC-MS分析，鉴定出其中39个成分，约占挥发油总量的90%以上，主要包括α-细辛醚、β-细辛醚、甲基异丁香酚等[3-5]。现代药理学研究表明，α-细辛醚能显着改善模型大鼠的学习记忆能力，亦能改善大鼠缺血再灌注所致的脑水肿，提高小鼠血脑通透性和耐缺氧能力；α-细辛醚能抑制乙酰胆碱酯酶，提高乙酰胆碱神经递质的水平，提示其可能具有治疗老年痴呆和益智作用的机制[6-9]。本研究重点对α-细辛醚和β-细辛醚进行质量控制，以期达到良好的结果，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AE240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），FA1604S分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

α-细辛醚对照品（100298-201203），β-细辛醚对照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度 70.9%，C10301000），通塞益脑口服液[规格：10 mL/瓶，医院制剂文号：南制字（2011）F01015]，石菖蒲（1 g/瓶，中国食品药品检定研究院，121098-201105），磷酸（分析纯，南京化学试剂有限公司），甲醇（色谱纯，美国TIEDA），水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Lichrospher-C18（4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（54∶46）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：257 nm；柱温：30℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液的制备

2.2.1.1 α-细辛醚对照品储备液的制备 称取α-细辛醚对照品12.48 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成124.8μg/mL的α-细辛醚对照品储备液。

2.2.1.2 β-细辛醚对照品储备液的制备 称取β-细辛醚对照品4.64 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成65.795μg/mL的β-细辛醚对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取通塞益脑口服液5支，置于烧杯中，混匀，精密吸取5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液

按处方量称取不含石菖蒲的其他药味，按生产工艺制备，得阴性样品，并依“2.2.2”项中供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μL注入色谱仪，记录色谱图。结果显示，α-细辛醚、β-细辛醚的保留时间分别约为30、39 min，阴性样品对测定无干扰。见图1。

2.3 标准曲线的制备

2.3.1 α-细辛醚线标准曲线

图1 高效液相色谱图

分别精密吸取α-细辛醚对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度分别为 1.248、2.496、3.744、4.992、6.240μg/mL的对照品溶液，进样测定其峰面积。以各对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=85 526X-1.0581，r=0.9999（n=5）。 表明 α-细辛醚在 1.248～6.240 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 β-细辛醚标准曲线

分别精密吸取 β-细辛醚储备液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度 ， 得 浓 度 分 别 为 2.632、5.264、7.896、10.528、13.159μg/mL的对照品溶液，进样测定其峰面积。以各对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=41 727X-0.0433，r=0.9999（n=5）。 表明 β-细辛醚的浓度在 2.632～13.159μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取“2.3”项中的 α-细辛醚和 β-细辛醚对照品溶液各 1 份（3.744、7.896 μg/mL），重复进样 5 次，记录色谱峰面积，测得α-细辛醚RSD为0.26%，β-细辛醚峰面积的RSD为0.26%。结果表明该方法的精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批（批号：130726）样品 5 份，按“2.2.2”项中方法制备供试液，依法测定，结果α-细辛醚平均含量为3.28μg/mL，β-细辛醚平均含量为15.82μg/mL，α-细辛醚RSD为0.67%，β-细辛醚RSD为2.37%。表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一批（批号：130726）供试品溶液，分别于0、1、2、4、8 h 时进样 20 μL， 测得 α-细辛醚、β-细辛醚峰面积的 RSD 分别为 0.32%（n=5）、0.31%（n=5）。表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

2.7.1 α-细辛醚加样回收率试验结果

精密吸取已知含量（批号：130726，α-细辛醚含量为3.28μg/mL）的样品6份，每份2.5 mL，置于10 mL量瓶中，分别精密加入α-细辛醚储备液0.1 mL，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为99.07%，RSD为2.15%。见表1。

表1 α-细辛醚加样回收率试验结果（n=6）

2.7.2 β-细辛醚加样回收率试验结果

精密吸取已知含量（批号：130726，β-细辛醚含量为15.82μg/mL）的样品6份，每份2.5 mL，置于10 mL量瓶中，分别精密加入β-细辛醚储备液0.5 mL，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为101.94%，RSD为2.83%。见表2。

表2 β-细辛醚加样回收率试验结果（n=6）

2.8 含量测定

取通塞益脑口服液3个批次，按“2.2”项中方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定并计算含量，具体结果见表3。综合3批样品测定结果，确定本品每瓶含挥发油以α-细辛醚和β-细辛醚总量计不得少于 100 μg（10 mL/瓶）。

表3 样品中 α-细辛醚和 β-细辛醚的含量测定（n=3）

2.9 薄层色谱鉴别

2.9.1 色谱条件

以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（12∶1）为展开剂；以5%磷钼酸乙醇溶液为显色剂；105℃加热约5 min至斑点显色清晰。

2.9.2 溶液的制备

取本品50 mL，用石油醚（60~90℃）振摇提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取石菖蒲对照药材1 g，研碎， 加石油醚 （60~90℃）50 mL室温超声20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方及制法，制成缺石菖蒲阴性对照样品，取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.9.3 阴性干扰试验

3个批次供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而石菖蒲阴性对照色谱相应位置无此斑点，证明阴性对照溶液对鉴别无干扰，结果见图2。

图2 石菖蒲的TLC图谱

3 讨论

3.1 流动相的选择

据文献报道，尝试乙腈-0.05%磷酸溶液（40∶60）、乙腈-1%醋酸溶液（50∶50）等流动相分离细辛醚 ，但因为中药复方制剂的成分复杂，个体差异大，故最终采用甲醇-0.05%磷酸溶液（54∶46），既保证了完好的分离度，又不至于分析时间太长。

3.2 指标成分的选择

吴启端等[13]经研究35份石菖蒲挥发油样品，结果发现共有成分相对百分含量中β-细辛醚均值为64.425%，α-细辛醚均值为11.680%，二者占总量的81.777%，是石菖蒲挥发油发挥药效的重要指标成分。目前国内无α-细辛醚（β-细辛醚）标准品，为国外购进[14-15]，纯度较低，需低温保存避光，给操作带来一定难度。β-细辛醚对照品色谱图显示含β-细辛醚、α-细辛醚两种成分，因此文中两个对照品需分别进样以免干扰。

3.3 稳定性考察

经过多批次的考察，本研究发现通塞益脑口服液中细辛醚的含量不一，可见石菖蒲药材质量差异较大[15]，故必须建立完整的半成品检验制度，对挥发油进行质量监测，使其保持在一个良好的水平。而初步的长期稳定性试验表明，由于挥发油的特殊性，其在制剂中的含量下降很快，分析可能是其易挥发或者多种成分互相转化等缘故。我们将进行进一步的试验，找出具体原因。

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