柯莹莹
（茂名市动物疫病预防控制中心，广东 茂名 525000）
超声波提取法是利用超声波辐射产生的强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力，从而加速目标成分进入溶剂[1]。此外Toma Maricela等人研究发现超声波在促进传质的同时还能促进水合，这也有助于中药有效成分的提取[2]。
水煎提取法是以水为提取溶剂，将药材加热煮沸一定的时间而获得煎煮液，并重复进行若干次，以提取其有效成分的一种传统方法。水煎提取法能提取较多的成分，对于有效成分尚未清楚的中药或方剂进行剂型改进时，通常采取煎煮法粗提[3]。
乌梅为蔷薇科植物。乌梅药食兼用，能开胃、生津、止渴。其果实中含有柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸及谷甾酸等，具有一定的抑菌防腐作用[4]。近年来，集约化、工厂化养殖方式的迅速发展，养殖产量的提高及抗生素等抗菌药物的使用，使养殖用水体日益恶化，水产品药物残留居高不下，所以进一步开展中草药在水产养殖上的应用研究成为必然趋势[5]，而缩短中药炮制时间，提高中药的利用效率更是势在必行。
本试验以乌梅作为供试中药，用超声波提取及传统水煎提取2种不同的提取方法，采用平皿打孔法、试管2倍稀释法，测定两种提取方式提取的乌梅提取液对于海洋致病性弧菌（创伤弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌）及希瓦氏菌地方菌株（鲍鱼希瓦氏菌），共四种菌的体外抑菌效果的影响，为优化提取流程，应用更高效率的提取方法提取中草药进行防治动物细菌性疾病提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验中药
供试中药：乌梅（购自茂名某药店）。
1.1.2 试验菌株
创伤弧菌、副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、哈氏弧菌。
1.1.3 试验试剂
营养琼脂、氯化钠（Nacl）、营养肉汤。
1.1.4 试验器材
三频多用途恒温超声提取机、生化培养箱、冰箱、洁净工作台、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器、高速冷冻离心机、微量移液器、游标卡尺。
1.1.5 药物样品的制备
（1）超声波提取液制备
称取乌梅10g，加水500 mL，浸泡30 min后，置超声波提取仪中，2.5 s工作间歇超声提取2次，每次30 min，然后过滤药液；合并2次药液，4000 r/ min离心10 min，除去沉淀，浓缩至10 mL，制备成药液浓度为1g/ mL的提取液，121℃高压灭菌20 min，置4℃冰箱备用。
（2）水煎液制备（煎煮法）
称取乌梅10g，加水500 mL，浸泡30 min后，文火煎煮2次，每次30 min，然后过滤药液；合并2次药液，4000 r/ min离心10 min，浓缩至10 mL，制备成药液浓度为1 g/ mL的水煎液。121℃高压灭菌20 min，置4℃冰箱备用。
1.1.6 培养基的制备
3.5 %NaCl营养琼脂（pH 7.8）、3.5%NaCl营养肉汤（pH 7.8）按常规方法配制。
1.1.7 供试菌液的制备
创伤弧菌、副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、哈氏弧菌经复壮、纯化后，接种到营养肉汤中，制成肉汤菌液，共接种2组。一组37℃恒温培养18h，用于药物敏感度测定试验；另一组培养8h，用于最小抑菌浓度（MIC）测定。
1.2 试验方法
1.2.1 供试中药药物敏感度测定
采用平皿打孔法[6]将试验菌株接种于营养肉汤中，37℃培养18 h，制成肉汤菌液。用灭菌棉签蘸取菌液均匀涂布于3.5%NaCl营养琼脂（pH7.8）平板上，然后用直径6 mm的打洞器均匀打洞，每皿打5个洞，去除洞内琼脂后将试验药液加于洞中，以满面不溢为宜并做好标记，每样品做2个重复，37℃恒温培养18h后取出，观察结果，测定抑菌圈直径，并取平均值记录结果。结果判断：抑菌圈直径小于10 mm为低度敏感或耐药，10~15 mm为中度敏感，大于15 mm为高度敏感[8]。
1.2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
采用试管二倍稀释法[7]测定样品对供试菌株的最小抑菌浓度（MIC），具体操作步骤如下：取无菌试管8支，第1管加入1.8 mL无菌营养肉汤，余下7管各加1 mL营养肉汤；以无菌操作吸取制备好的药物0.2 mL加入第1管中，混匀后吸取1 mL加入第2管中，依次倍比稀释至第7管，混匀后自第7管弃去1 mL。此时，管中药液浓度比依次为1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，第8管不加药物作为阳性对照。
将培养8h的供试菌液，用无菌肉汤稀释成10-3浓度的实验菌液，然后各管均加入实验菌液0.2 mL，充分混匀后，置于37℃培养箱培养16~18h，观察结果。若肉汤混浊，表示细菌生长，若肉汤完全清亮，表示无细菌生长。
以肉眼观察，无细菌生长的试管中最低药物浓度为该药的最小抑菌浓度（MIC）。
1.2.3 最小杀菌浓度（MBC）测定
将上述MIC测定中未生长细菌的各管中肉汤接种于营养琼脂平板上，做好标记，37℃培养16~18h，观察结果。以有无菌落生长作为指标检查试管中有无细菌生长，以仍无细菌生长的管内药物的浓度为该药的最小杀菌浓度（MBC）[7]。
2 结果
2.1 供试中药药物敏感度测定
供试中药乌梅对供试菌株具有良好的体外抑菌效果，呈高度敏感，详见表1，实验数据表明，2种提取方法对乌梅的体外抑菌效果均呈高度敏感，但水煎提取法的乌梅提取液抑菌圈比超声波提取的乌梅提取液抑菌圈稍大一点，说明水煎提取法对乌梅的体外抑菌效果比超声波提取法的体外抑菌效果更好。
表1 供试中药乌梅药物敏感度测定结果（抑菌圈直径/mm）
2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
乌梅的超声波提取液对创伤弧菌、副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、哈氏弧菌的MIC为1∶80；乌梅的水煎提取液对创伤弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌的MIC均为1∶160，对鲍鱼希瓦氏菌的MIC为1∶80，详见表2。水煎提取法液的体外抑菌效果比超声波提取液的体外抑菌效果更佳，且水煎提取法提取的乌梅提取液对弧菌的体外抑菌效果比对希瓦氏菌的体外抑菌效果更佳。
表2 乌梅的最小抑菌浓度（MIC）测定结果（单位：g/mL）
乌梅提取液药物敏感度测定结果如图1~图4，培养皿中左边2个抑菌圈为超声波乌梅提取液的试验结果，右边2个抑菌圈为水煎乌梅提取液的试验结果。
图2 乌梅提取液对副溶血弧菌的药物敏感度试验
图3 乌梅提取液对鲍鱼希瓦氏菌的药物敏感度试验
图4 乌梅提取液对哈氏弧菌的药物敏感度试验
2.3 最小杀菌浓度（MBC）测定结果
乌梅的超声波提取液对创伤弧菌、哈氏弧菌的MBC为1∶40，对副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌的MBC为1∶80；乌梅的水煎提取液对创伤弧菌、副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、哈氏弧菌的MBC均为1∶80，详见表3。最小杀菌浓度（MBC）测定结果与最小抑菌浓度（MIC）相似，乌梅水煎提取液的体外杀菌效果比乌梅超声波提取液的体外杀菌效果略好。
表3 供试中药乌梅最小杀菌浓度（MBC）测定结果（单位：g/mL）
3 讨论
超声波能大大提高植物中的多糖类物质、类固醇和三萜系化合物、抗氧化活性的化合物的提取速率，但由于超声波作用能断开两碳原子之间，所以在超声提取过程中会产生很多具有较强活性的自由基，能与许多抗氧化性物质反应，破坏活性成分[8]。乌梅中含有大量有机酸、黄酮、萜类、甾醇、脂类、挥发性成分、生物碱、糖类、歧化酶、维生素C、维生素B1、维生素B2等活性成分[9]，加上中药提取后储藏一段时间后才进行试验，乌梅超声波提取液中部分有效成分更容易被破坏。有试验证明，乌梅本身的热稳定性很高[10]，故本试验中水煎提取、高压灭菌所产生的高温对乌梅的药效影响并不大。因此推定，乌梅的超声波提取液药效不如水煎提取液的药效。
研究表明，超声波提取对于植物种子的物质膨胀指数有较好的促进作用[2]。在本试验过程中，乌梅经过超声波提取之后明显膨胀，形成一大团的絮状物，在用纱布过滤的过程中有大量的混有提取液的沉渣无法被过滤，可能有部分有效物质或有害物质残留在沉渣中未被析出，对试验结果造成误差。
4 结论
（1）超声波与水煎提取法提取的乌梅提取液对创伤弧菌、副溶血弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、哈氏弧菌的体外抑菌效果均呈高度敏感。
（2）水煎提取法相比超声波提取法可产生更好的体外抑菌效果。
