胡蓉蓉，马 杰，陶建瓴，文煜冰，赵 翠，张 薇，李 航，李明喜，李雪梅，李学旺中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肾内科，北京00730
2沧州市人民医院肾内科，河北沧州061000
糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN)是我国终末期肾病 (end stage renal disease，ESRD)的第2大原因。DN发病机制复杂，至今尚不完全明确。钙调神经素 (calcineurin，CaN)是一种钙离子敏感的蛋白磷酸激酶，环孢素A能通过抑制CaN，调节足细胞骨架蛋白synatopodin的稳定性［1］。内质网应激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)是指细胞内质网未折叠或错误折叠蛋白堆积时引起的细胞应激反应。近来研究显示，内质网应激时CaN活性增加［2］。糖尿病患者体内游离脂肪酸升高，体外细胞实验证明游离脂肪酸，尤其是长链饱和游离脂肪酸——棕榈酸盐能引起ERS［3］。熊去氧胆酸 (ursodeoxycholic acid，UDCA)是内质网应激的化学分子伴侣，体外大鼠肝细胞及糖尿病模型小鼠实验都证明UDCA能降低ERS感应蛋白双链RNA依赖的蛋白质激酶 (double-stranded RNA-dependent protei，PKR)类似的内质网激酶 (PKR-like ER kinase，PERK)和肌醇依赖酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE-1α)的磷酸化，抑制ERS依赖的JNK凋亡途径，缓解ERS引起的损伤，故常被用作ERS的阻断剂。本课题组前期工作发现早期DN中足细胞存在ERS，本研究观察了早期DN时足细胞ERS对CaN表达的调控情况，以期明确ERS状态下足细胞CaN的变化，为寻找以调节ERS来阻断早期DN进展的临床治疗决策提供进一步理论依据。
材料和方法
实验动物雄性C57BLKS/JLeprdb/db和C57BLKS/JLeprdb/m小鼠，购于南京大学模式动物研究所。
足细胞培养足细胞在33℃，含10%胚牛血清(BSA)、青霉素/链霉素 (Gibco，英国)和干扰素Υ(R＆D，美国)的RPMI-1640培养液中生长，37℃无干扰素Υ培养液中分化。所有实验细胞均分化14 d。
棕榈酸盐溶液配制BSA溶解于双蒸水配成5%(质量/体积)的溶液并过滤，100mmol/L棕榈酸盐(Sigma，美国)在60℃ 0.1mmol/L氢氧化钠溶液中溶解并过滤，用5%BSA稀释至5mmol/L。溶液冷却至室温，4℃冰箱保存。将5mmol/L棕榈酸盐/5%BSA溶液与无血清培养液按不同比例混合，其中1mmol/L棕榈酸盐为最大浓度组。棕榈酸盐组的对照是1%BSA。
共聚焦显微镜显像4%多聚甲醛固定后，用含1%BSA的磷酸溶液缓冲液 (PBS)封闭足细胞，1∶25(体积比)稀释度的兔抗鼠钙调神经素多克隆抗体(抗CaN)(Cell signaling，美国)孵育，再用FITC结合羊抗兔多克隆抗体 (北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育后PBS清洗，DAPI标记细胞核后，共聚焦显微镜下观察。
蛋白印迹法冰PBS清洗分化足细胞后，用RIPA裂解液裂解，100℃变性5min。用12%SDS聚乙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白电转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidencefluoride，PVDF)，将膜在抗 CaN和抗GAPDH(Abcam，英国)单抗中孵育，再用二抗杂交，ECL显影。
实时荧光定量逆转录多聚酶链反应定量分析转录子用TRIzol(Invitrogen，美国)提取足细胞RNAs，并反转录成cDNA作为PCR模板，采用iQ5循环变温加热器 (BioRad，美国)进行实时荧光PCR。试验中所用的引物设计如下:(1)Calcineurin:Forward:5’-GATGCTGG TCAATGTTCTC-3’;Reverse:5’-CAGGACACTCTCACTCTC-3’。(2)β-actin:Forward:5’-CTCTC CCTCACGCCATCC-3’;Reverse:5’-CTCTCCCTCACGC CATCC-3’。
统计学处理采用SPSS 16.0统计软件，所有数据以均数±标准差表示，采用方差齐性分析，正态分布数据差异显着性检验采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
早期DN小鼠模型中足细胞CaN的表达6、9、12周db/m小鼠的24h尿白蛋白水平分别为 (1.5977±1.8720)、(5.4114±5.2605)、 (1.1231±0.4286)μg，db/db小鼠分别为 (30.7268±7.7615)、(196.0933±79.8682)、(185.4407±111.6092)μg，其中，db/db小鼠的24h尿白蛋白水平均明显高于同周龄的db/m小鼠(P均＜0.001)，9、12周龄db/db小鼠的24h尿白蛋白水平均明显高于6周龄db/db小鼠 (P均＜0.01)。
选取6、9、12周龄24h尿白蛋白量分别为31.98、143.91、315.49μg的db/db小鼠和6、9、12周龄24h尿白蛋白量分别为1.52、2.35、0.24μg的db/m小鼠进一步观察CaN及synaptopodin表达情况，激光共聚焦显微镜下可见小鼠肾组织中CaN蛋白分布与synaptopodin相似，且同周龄db/db小鼠的CaN表达高于db/m小鼠。CaN在db/db小鼠足细胞中的表达随尿白蛋白量的增加而增强 (图1)。
体外培养小鼠足细胞在不同浓度棕榈酸盐作用下CaN的表达将足细胞在0.25和0.50 mmol/L棕榈酸盐培养液中孵育3h后，CaN mRNA相对表达量分别为1.17±0.20和1.52±0.45，明显高于BSA培养液的0.96±0.09(P均＜0.05)。
激光共聚焦显微镜观察棕榈酸盐和UDCA共同作用下体外足细胞CaN的表达以1%BSA为对照组，将分化的足细胞分别在0.25 mmol/L棕榈酸盐、0.25 mmol/L棕榈酸盐 +0.01 mmol/L UDCA、0.01 mmol/L UDCA继续培养3 h，激光共聚焦显微镜下观察发现，棕榈酸盐作用下足细胞CaN蛋白的表达增强，棕榈酸盐联用UDCA作用下的足细胞CaN表达减弱 (图2)。对每个标记CaN的免疫荧光标本观察20个完整细胞，比较足细胞CaN免疫荧光强度，结果显示1%BSA对照组、0.25 mmol/L棕榈酸盐组、0.25 mmol/L棕榈酸盐+0.01 mmol/L UDCA组和0.01 mmol/L UDCA组的免疫荧光强度分别为(243.44±26.87)、(326.74±41.18)、(249.05±40.96)和 (215.19±25.28)I/μm2，其中，0.25 mmol/L棕榈酸盐组明显高于1%BSA对照组 (P＜0.05)，0.25 mmol/L棕榈酸盐+0.01 mmol/L UDCA组明显低于0.25 mmol/L棕榈酸盐组 (P＜0.05)，0.01 mmol/L UDCA组明显低于1%BSA对照组 (P＜0.05)。
图1 小鼠肾小球激光共聚焦图像 (40×10×2.5)Fig 1 Confocal microscopy of mice glomeruli(40×10×2.5)
蛋白印迹法检测棕榈酸盐及UDCA作用下体外足细胞CaN的表达蛋白印迹法对不同刺激下足细胞CaN mRNA表达的检测结果显示，棕榈酸盐作用组CaN的表达较BSA组升高，而棕榈酸盐加UDCA组CaN的表达较棕榈酸盐作用组降低 (图3)。
图2 小鼠足细胞CaN标记的激光共聚焦图像 (40×10×2.5)Fig 2 Confocal microscopy of CaN in immortalized mouse podocytes(40×10×2.5)
图3 不同刺激物作用下足细胞CaN表达的蛋白免疫印迹结果Fig 3 Western blotting of CaN in podocytes treated with different stimulants
讨 论
CaN是一种丝氨酸/苏氨酸特异的蛋白磷酸酶，由相对分子质量为59 000的催化亚单位A(CNA)和19 000的调节亚单位B(CNB)组成，CNA具有磷酸酶单位，CNB能结合钙离子和CNA，CaN通过CaM感受细胞内Ca2+的浓度调节自身活性，发挥作用。在阿尔茨海默病等神经系统疾病中，蛋白错误折叠及堆积引起的ERS是其常见且典型的病理生理特点，而且很可能是致病的启动因子［4-5］，这些疾病中存在CaN活性的增加［6-7］。2010年，国内有报道ERS诱导剂毒胡萝卜素 (thapsigargin，TG)作用大鼠新生心肌细胞时，存在心肌细胞肥大，细胞内Ca2+上升，CaN表达上调，加用环孢素A能抑制心肌肥大［2］。目前尚没有研究观察DN时足细胞中CaN表达的变化情况。本研究通过对早期DN小鼠模型足细胞的观察，发现早期DN小鼠中存在足细胞CaN表达的升高。
Chen等［8］研究发现，大鼠心肌缺血/再灌注损伤中，网钙蛋白、CHOP及半胱天冬酶-12等ER分子伴侣表达升高，且CaN的表达也升高，缺血/再灌注损伤上调CaN表达并强化了ERS引起的损伤。本课题组前期研究发现，随着尿蛋白量的增加，ERS的标志蛋白GRP78在db/db小鼠足细胞的表达增强。本研究对同一小鼠模型肾小球CaN表达进行激光共聚焦显像观察发现，CaN表达的变化与GRP78一致，并由此推测足细胞ESR时伴有CaN表达上调。
本课题组前期研究及文献报道发现足细胞在棕榈酸盐刺激下产生ERS［9］。本研究进一步探究ERS时CaN表达的变化情况，以棕榈酸盐刺激3h的足细胞为观察对象，在激光共聚焦显微镜下观察到足细胞CaN表达升高;而Real-Time PCR CaN mRNA水平的半定量分析发现，随着棕榈酸盐刺激浓度的增加，CaN mRNA水平也增加。
2002年Xie等［10］在人体肝脏细胞系 (Huh 7)中研究发现，牛磺熊去氧胆酸 (taurousodeoxycholic acid，TUDCA)具有抑制ER内Ca2+外流，激活ERS标志蛋白GRP78及凋亡前因子caspase-12的作用，故被作为ER化学分子伴侣的抑制剂，并用于抑制ERS的比较研究，UDCA和TUDCA降低GRP78的作用程度相似。2006年，Ozcan等［11］在体内研究发现，db/db小鼠口服摄入TUDCA能明显使血糖正常化，并改善组织对胰岛素的反应。进一步研究显示，TUDCA处理小鼠的PERK和IRE-1α磷酸化及JNK的活化被抑制，而同时对胰岛素受体信号具有反向调节作用的胰岛素受体信号-1也被抑制，胰岛素受体信号能力有明显恢复。此外，在db/db小鼠心肌细胞的研究发现，TUDCA能缓解FFA/ERS引小的心肌收缩功能障碍［12］。故本研究设计了棕榈酸盐联合UDCA作用的细胞组，激光共聚焦和蛋白免疫印迹检测均发现在棕榈酸盐联用UDCA与单用棕榈酸盐相比，CaN的表达减低。结合UDCA在胰岛素抵抗及ERS中的作用，推测在足细胞中，通过抑制ERS可以减弱CaN的表达。
Faul等［1］研究发现，环孢素A的抗尿蛋白作用主要是通过直接抑制足细胞钙神经蛋白介导synaptopodin的去磷酸化，稳定细胞骨架结构、促进足细胞修复实现的。在小鼠肾脏冰冻切片激光共聚焦试验中，应用synaptopodin绿色荧光标记足细胞，红色荧光显示CaN，激光共聚焦三通道同时摄像观察，能较客观地分析功能蛋白的形态学分布，比较其表达变化。本研究观察发现，在db/db小鼠肾组织，随尿蛋白量的增加，CaN的表达也增强，6周龄db/db小鼠肾小球内分布的CaN与同周龄db/m小鼠无明显差别，但9周龄db/db小鼠的CaN较同周龄db/m小鼠有明显增加，并且这个信号的增强在12周龄时呈递增趋势;而synaptopodin的表达强度在6周龄db/db小鼠中与正常小鼠相似，9周龄和12周龄db/db小鼠均较正常小鼠减弱，两者差别不明显。
与在肝细胞、心肌细胞等得到的结果类似，本研究在足细胞中发现，通过UDCA阻断ERS时，CaN表达上调被抑制，这点提示或许在早期DN的治疗中可以使用UDCA，通过缓解ERS而得到阻断早期DN进展的临床期望。该点尚需要更多基础和临床深入研究以得到明确和证实。
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