杨国雷　张复华　凌奕文　牛国敏

成人特发性血小板减少性紫癜患者外周血γδT细胞及IL-17、IL-23水平的变化和意义

杨国雷张复华凌奕文牛国敏

【摘要】目的 通过检测ITP患者外周血γδT细胞、IL-17与IL-23水平的变化，进一步探讨ITP的发病机制，为ITP的防治新途径提供理论依据。方法 采用流式细胞术检测外周血γδT细胞；酶联免疫吸附试验方法检测 IL-17、IL-23。实验组分正常对照组和ITP组；ITP组分为治疗前组与治疗后组（有效组、无效组）；ITP组初始均予地塞米松10 mg/d，此后口服强的松维持并逐渐减量，总疗程1个月。结果 正常对照组外周血γδT、IL-17、IL-23分别为（6.41±1.76）%，（43.04±6.10）pg/ml，（34.03± 3.64）pg/ml；ITP治疗前组：γδT、IL-17、IL-23分别为（14.90±2.41）% ，（76.67±11.86）pg/ml，（63.06±12.08）pg/ml；治疗有效组：γδT、IL-17、IL-23 分别为（7.19±1.29）%，（53.95±11.97）pg/ml，（37.12±3.89）pg/ml；治疗无效组：（12.87±2.11）%，（62.51±10.11）pg/ml，（58.42±10.08）pg/ml。结论 ITP患者外周血γδT细胞、IL-17、IL-23水平较正常人高，γδT细胞、IL-17、IL-23参与了ITP的发生发展；ITP患者治疗有效者γδT细胞、IL-17、IL-23水平下降。

【关键词】ITP；γδT细胞；白介素-17；白介素-23

作者单位：528200佛山，南方医科大学附属南海医院

Changes and Significance of Peripheral Blood γδT Cells and IL-17 and IL-23 Levels in Patients With Idiopathic Thrombocytopenic Purpura

YANG Guolei ZHANG Fuhua LING Yiwen NIU Guomin, Affiliated Nanhai Hospital of Southern Medical University, Foshan 528200, China

[Abstract]Objective To explore the pathogenesis of idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP), and provide theoretical basis for new pathways to the prevention and control of ITP, through testing γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patients. Methods γδT cells in peripheral blood was testing by flow cytometry. IL-17 and IL-23 in peripheral blood was testing by enzyme-linked immunosorbent assay. Experiment group was divided into normal control group and ITP patient group. ITP patient group was divided into pre-treatment group and

treatment group(effective and non-effective group). ITP patient group was initially given dexamethasone 10 mg/d, following oral prednisone(reduced gradually), total course lasting a month. Results γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of normal control group were(6.41±1.76)%,(43.04± 6.10)pg/ml,(34.03±3.64)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP pre-treatment group were(14.90±2.41)%,(76.67±11.86)pg/ml,(63.06±12.08)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP effective treatment group were(7.19±1.29)%,(53.95±11.97)pg/ml,(37.12±3.89)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP non-effective treatment group were(12.87±2.11%)%,(62.51±10.11)pg/ml,(58.42±10.08)pg/ml. respectively. Conclusion The level of γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patient was higher than that in normal peoplem, therefore they play a part in the development of ITP. After effective treatment, the level of γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patient declined.

[Key words]ITP, γδT, IL-17, IL-23

特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是临床最为常见的出血性疾病，研究证实T淋巴细胞异常在ITP发病中起重要作用。本研究通过检测ITP患者外周血γδT细胞、IL-17与IL-23水平的变化，进一步探讨ITP的发病机制，为ITP的预后、治疗提供新的理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

对照组来自门诊健康体检者：18～60岁，男女不限，近期无感染、免疫性疾病病史；无使用免疫抑制剂药物史。ITP组：2013年1月～2015年1月在我院住院治疗的ITP患者27例，男12例，女15例， 年龄18～60岁，血小板＜30×109/L，伴临床出血，诊断符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》（第三版）。

1.2研究分组

研究分组分为正常对照组与ITP组，ITP组分为治疗前组与治疗后组。所有患者初始均予地塞米松10 mg，静滴，1次/日，后续口服强的松并逐渐减量；血小板极低伴出血严重者，联合丙种球蛋白[0.4 g/（kg·d），ivdrip，3～5 d]，机采血小板及止血支持治疗。治疗时间均为1月，再次采血检验。疗效标准依据《血液病诊断及疗效标准》（第三版）。

1.3实验方法

1.3.1流式细胞术外周血γδT细胞的检测 （1）空腹，EDTA抗凝管采静脉血2 ml；（2）取流式管2支，各加入样本100 μl；（3）对照组加入IgG1-FITC，IgG2a-PE抗体，各10 μl；测试管加入CD3-PE，γδTCR-FITC抗体，各10 μl，震荡摇匀，室温下避光25～30 min；（4）各管加入2 ml FACS溶血素，震荡摇匀，室温下避光8～12 min；（5）震荡摇匀，1 000 r/min，5 min，弃上清液；沉淀中加入2 ml磷酸盐缓冲液（PBS液），震荡摇匀，1 000 r/min，5 min，弃上清液；（6）沉淀中加入0.5 ml含1%多聚甲醛的PBS缓冲液，震荡摇匀，2℃～8℃保存，24 h内上机检测；（7）以FS/SS，做点图，设淋巴细胞门；再以F1/F2（CD3/ γδTCR）做点图，画出象限，以阴性管调节电压、阈值；以阳性管调节补偿，获取细胞后，分析外周血CD3/γδTCR双阳性细胞百分比。

1.3.2酶联免疫吸附试验方法检测 IL17、IL23 （1）加样：分别设空白孔与待测样品孔；（2）温育、洗涤；（3）加酶、温育、洗涤；（4）显色：每孔加入显色剂，轻轻震荡混匀，避光显色15 min；（5）终止：每孔加终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）；（6）测定：以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）测定应在加终止液后15 min以内进行。

1.4统计学方法

所有数据均用SPSS 11.0统计软件处理，计量资料以（均数±标准差）（x-±s）表示；采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ITP患者外周血γδT细胞水平

正常对照组外周血γδT为（6.41±1.76）% ；ITP治疗前组：γδT为（14.90±2.41）%；治疗有效组：γδT为（7.19±1.29）%；治疗无效组：γδT为（12.87±2.11）%。

2.2ITP患者外周血IL-17、IL-23水平

正常对照组外周血IL-17、IL-23分别为（43.04±6.10）pg/ml、（34.03±3.64）pg/ml；ITP治疗前组：L-17、IL-23分别为（76.67±11.86）pg/ml、（63.06±12.08）pg/ml；治疗有效组：IL-17、IL-23 分别为（53.95±11.97）pg/ml、（37.12±3.89）pg/ml；治疗无效组：L-17、IL-23分别为（62.51±10.11）pg/ml、（58.42±10.08）pg/ml。

3　讨论

越来越多的研究证实T淋巴细胞异常在特发性血小板减少性紫癜发病中起重要作用。外周血成熟T淋巴细胞按其抗原识别受体（TCR）不同，分为αβT细胞与γδT细胞。αβT淋巴细胞异常在ITP发病中的作用研究较多且得到证实，主要表现在Th1/Th2细胞亚群平衡失调；细胞毒T细胞（CTL）介导的血小板破坏；调节性T细胞（Treg Cell）减少[1]等。γδT细胞能够诱导初始αβT细胞的增殖、分化，参与自身免疫性疾病的发生发展。γδT细胞表面表达IL-23受体（IL-23R），与IL-23结合，产生大量IL-17，引起免疫炎症反应[2-3]。此外，γδT可通过表达IL-23R途径，能够抑制调节性T细胞（Treg）的活性，增强免疫炎症反应[4]。总之，γδT细胞及IL-17、IL-23在自身免疫相关性疾病发生发展中起重要作用，且关系密切。然而，关于γδT细胞及IL-17、IL-23在特发性血小板减少性紫癜中的研究报告却非常少见。Russell E. Ware RE等研究发现[5]，γδT在儿童特发性血小板减少性紫癜（ITP）部分患者中表达增多，且与血小板减少程度有关，提示γδT在ITP发病中起重要作用；而国内尚未见有关γδT细胞在ITP发病中的作用的研究报告。冯越等[6]报告32例儿童ITP患者IL-17、IL-23水平较正常对照组升高，差异有统计学意义。Rocha AM等[7]发现慢性ITP患者较正常对照组，外周血中IL-17A升高，且有统计学意义。然而，Ma DX等[8]发现慢性ITP患者组与健康对照组血浆中IL-17浓度无显着差异。

我们进行了18例正常对照组与27例ITP患者外周血γδT细胞、IL-17与IL-23水平的检测，发现ITP患者外周血γδT细

胞、IL-17、IL-23水平较正常人明显升高；27例患者经统一剂量激素治疗1月，治疗有效组17例，治疗无效组10例，再次进行外周血γδT细胞、IL-17与IL-23水平的检测，结果发现治疗有效组γδT细胞、IL-17、IL-23水平细胞水平较治疗前下降；而治疗无效组γδT细胞、IL-17、IL-23水平较治疗前无明显下降。因此提示γδT细胞、IL-17、IL-23参与了特发性血小板减少性紫癜的发生发展，糖皮质激素治疗有效者γδT细胞、IL-17、IL-23水平下降。由于本实验时间有限，展望下一步可采用主要对T细胞功能抑制的环孢素进一步研究，尤其针对糖皮质激素治疗无效患者，观察环孢素对该类患者γδT细胞、IL-17、IL-23水平的影响，以及与疗效的关系。

参考文献

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[4] Petermann F. T Cells Enhance Autoimmunityby Restraining Regulatory T Cell Responsesvia an Interleukin-23-Dependent Mechanism[J]. Immunity，2010，33（3）：351-363.

[5] Ware RE. Elevated Numbers of Gamma-Delta T Lymphocytesin Children with Immune Thrombocytopenic Purpura[J]. Journal of Clinical Immunology，1994，14（4）：237-247.

[6]冯越. 特发性血小板减少性紫瘢患儿Th17细胞及其相关细胞因子的检测[J]. 徐州医学院学报，2011，31（10）：697-698.

[7]Rocha AM. The levels of IL-17A and of the cytokines involved in Th17 cell commitment are increased in patients with chronic immune thrombocytopenia[J]. Haematologica，2011，96（10）：1560-1564.

[8]Ma DX，Zhu XJ，Zhao P，et a1. Profile of Thl7 cytokines(IL-17, TGF-β, IL-6)and Thl cytokine(IFN-)in patients with immune thrombocytopenic purpura[J]. Annals of Hematology，2008，87（11）：899-904.

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.027

【文章编号】1674-9308（2015）24-0041-03

【文献标识码】B

【中图分类号】R593.2