不同给药方法治疗细菌性阴道病对阴道微生态环境及免疫因子表达的影响

王芳，霍彦，刘艳妍，尹利荣△

不同给药方法治疗细菌性阴道病对阴道微生态环境及免疫因子表达的影响

王芳1，霍彦2，刘艳妍3，尹利荣1△

目的 监测细菌性阴道病（BV）患者不同给药方法治疗前后阴道微生态恢复情况及局部免疫因子水平，探索药物选择与疗效转归的关系。方法 选取健康女性25例为对照组，BV患者100例为治疗组。治疗组按随机数字表法分为A～D组，每组25例。A组甲硝唑阴道泡腾片；B组甲硝唑阴道泡腾片+乳杆菌活菌胶囊；C组硝呋太尔阴道片；D组硝呋太尔阴道片+乳杆菌活菌胶囊。A、C组均每晚给药1粒，共7 d，B、D组两种药物按先后顺序分别每晚1粒给药7 d，共14 d。应用微生态评价体系及酶联免疫吸附法比较治疗组与对照组之间及各组BV患者治疗前后的临床疗效、阴道微生态重建及阴道灌洗液中白细胞介素-8（IL-8）、Toll样受体2（TLR2）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）的水平。结果 与对照组相比，治疗组均存在阴道菌群紊乱、pH值升高和微生态失调现象。治疗前，治疗组阴道灌洗液中IL-8水平与对照组差异无统计学意义，TNF-α及TLR2水平均高于对照组（P＜0.05），各治疗组间免疫因子水平差异无统计学意义。治疗后，B、D组治疗有效率及阴道微生态恢复率均高于A、C组（P＜0.05），IL-8水平与A、C组差异无统计学意义，TNF-α及TLR2水平均低于A、C组（P＜0.05）。结论 利用微生态评价系统辅助评判不同给药方案治疗BV效果证实硝呋太尔阴道片联合乳杆菌活菌胶囊序贯给药方案在临床疗效、阴道微生态重建及阴道局部免疫恢复方面优于传统甲硝唑单独给药治疗。

阴道病，细菌性；乳杆菌属；甲硝唑；硝呋拉太；白细胞介素8；Toll样受体2；肿瘤坏死因子α

细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）是生育期女性最常见的生殖道感染，可诱发严重的并发症，如胎膜早破、早产、性传播疾病等。流行病学研究显示20%～30%生育期女性的性传播疾病与BV相关，高危人群中BV的患病率可达50%～60%，且其与人类免疫缺陷病毒（HIV）、单纯疱疹病毒2型、沙眼衣原体及淋球菌感染相关，近年来已经发展为公共健康问题［1］。BV的明确病因尚不清楚，其主要表现为阴道内正常菌群数量减少，代之以阴道加德纳菌、厌氧菌和支原体等大量增加的临床症候群。研究发现，BV难治性及反复性的原因是由于患者阴道内可形成多菌种生物膜，其中以加德纳菌属及奇异菌属（Atopobium vaginae）为主，使得单一抗菌药难以完全清除阴道生物膜，而且抗菌药对于正常的阴道菌群也可造成负面影响，这种情况促进了临床医生改变BV治疗策略的研究［2］。因此，阴道微生态及阴道局部免疫环境变化与BV的关系已成为研究热点，探讨不同治疗方案对BV患者阴道微生态环境重建及局部免疫因子调节是本研究重点。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年6月—12月就诊于天津医科大学第二医院妇科、计划生育科门诊的育龄女性作为研究对象。纳入标准：（1）年龄18～45岁，有性生活史，月经正常。（2）采用Amsel临床诊断标准及革兰染色Nugent评分诊断标准确诊的BV患者［3］。排除标准：妊娠或哺乳期妇女；有阴道出血；阴道和宫颈分泌物检查有阴道滴虫、支原体、衣原体和淋病等；合并内、外科和免疫系统疾病或有全身其他部位感染；使用免疫抑制剂或对甲硝唑、硝呋太尔过敏者；3个月内使用过糖皮质激素；1个月内使用口服避孕药等激素类药物；2周内使用过抗生素。3 d内有阴道冲洗、性生活史和手术操作史的患者。本研究经本院伦理委员会审批通过，研究对象均知情同意。入选研究对象共125例，其中对照组25例，年龄（35±7）岁，治疗组100例，年龄（36±7）岁，2组年龄差异无统计学意义（t=0.683，P＞0.05）。依随机数字表法将治疗组分为A～D组，每组25例。A组：给予甲硝唑阴道泡腾片（吉林敖东延边药业股份有限公司，0.2 g/粒）；B组：给予甲硝唑阴道泡腾片+乳杆菌活菌胶囊（内蒙古双奇药业股份有限公司，0.25 g/粒）；C组：给予硝呋太尔阴道片（意大利多帕药业有限公司，0.25 g/粒）；D组：给予硝呋太尔阴道片+乳杆菌活菌胶囊。A、C组均每晚给药1粒，共7 d；B、D组均为两种药物，分别序贯每晚1粒各给药7 d，共14 d。给药途径：阴道填塞上药。停药后1周复诊，同治疗前诊断标准评判BV治疗效果及微生态恢复情况并留取阴道灌洗液。治疗及复诊前禁止性生活、阴道灌洗及服用抗生素。

1.2 方法

1.2.1 阴道分泌物采集及检测 无菌长棉签取阴道壁上1/3分泌物，生理盐水湿片检查清洁度，分泌物涂片革兰染色后显微镜检测菌群密度及菌种。pH 3.8～5.4精密试纸测定阴道pH值。采用阴道炎联合检测试剂盒（购自江苏硕世生物科技有限公司）检测过氧化氢酶、唾液酸苷酶和白细胞酯酶用于评价微生物功能。

1.2.2 阴道灌洗液采集 无菌生理盐水3 mL冲洗阴道侧壁上1/3及宫颈，停留30 s后回吸，室温下500×g离心10 min，取上清液分装后-20℃保存。

1.3 BV诊断及阴道微生态评价标准

1.3.1 Amsel临床诊断标准 （1）阴道分泌物呈稀薄乳样。（2）阴道pH＞4.5。（3）氮试验阳性。（4）线索细胞阳性。以上4项有3项阳性即为BV患者。Nugent评分≥7分为细菌性阴道病。

1.3.2 阴道微生态检测指标 依据曾忠铭等［4］提出的通过菌群密集度、菌群多样性、优势菌等指标进行阴道菌群的微生态评价。阴道分泌物经革兰染色后显微镜检测。菌群密集度：根据油镜下每视野平均细菌数分为Ⅰ级1～9个/油镜，Ⅱ级10～99个/油镜，Ⅲ级100～999个/油镜，Ⅳ级1 000个以上/油镜。菌群多样性：根据油镜下每视野能辨别的细菌菌群数分为，Ⅰ级1～3种/油镜，Ⅱ级4～6种/油镜，Ⅲ级7～9种/油镜，Ⅳ级：10种以上/油镜。优势菌：根据所见最多的微生物定义为优势菌。

1.4 阴道灌洗液免疫因子测定 酶联免疫吸附法定量检测各组阴道灌洗液中白细胞介素-8（IL-8）、Toll样受体2 （TLR2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），试剂盒购自天津达科生物科技有限公司，按照说明书的操作步骤进行检测。

1.5 疗效评价指标 临床疗效评价指标：（1）治愈。症状及体征消失，阴道分泌物检查阴性，Nugent评分0～3分。（2）好转。症状及体征与治疗前比减轻，Nugent评分4～6分。（3）未愈。症状及体征与治疗前比无明显变化或加重，Nugent评分≥7分。治愈与好转的总和为有效。阴道微生态评价指标［5-6］：（1）正常或恢复。阴道分泌物pH≤4.5、菌群密集度及多样性Ⅱ～Ⅲ级、优势菌为革兰阳性大杆菌（乳杆菌）、H2O2和唾液酸苷酶阴性、Nugent评分≤3分；（2）未恢复。pH＞4.5、菌群密集度及多样性Ⅰ或Ⅳ级、优势菌为革兰阴性短杆菌、球菌或杂菌、H2O2和（或）唾液酸苷酶阳性、Nugent评分4～6分或≥7分。

1.6 统计学方法 数据用SPSS 13.0统计软件处理，计数资料组间比较采用χ2检验或非参数秩和检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组内治疗前后比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BV患者治疗前后疗效比较 停药1周后随访患者90例，失访率为10%。健康女性与BV患者临床表现及阴道微生态差异主要表现：BV患者多有阴道瘙痒，稀薄白带，伴有鱼腥味，阴道pH＞4.5，清洁度为Ⅰ或Ⅱ度，胺试验阳性，线索细胞均为阳性，阴道分泌物革兰染色显示阴道加德纳菌占优势，密度增高至Ⅳ级，乳杆菌偶见或缺乏。正常健康女性阴道pH＜4.5，分泌物涂片以乳杆菌为优势菌，菌群密度Ⅱ～Ⅲ级，见图1。BV治疗组4种治疗方案用药前后治疗有效率比较差异有统计学意义（P＜0.05），B、D组有效率均高于A、C组（均P＜0.05）；A组与C组，B组与D组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1 Efficacy of different administration regimens表1 不同治疗方案临床疗效比较

2.2 BV患者治疗后阴道微生态恢复情况 BV治疗组4种治疗方案用药后阴道微生态恢复情况差异有统计学意义（χ2=11.315，P＜0.05），A～D组恢复患者数分别为13例（56.52%）、19例（86.36%）、13例（59.09%）和21例（91.30%），B、D组恢复患者比例均高于A、C组（均P＜0.05），A组与C组，B组与D组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 对照组与BV治疗组治疗前后阴道局部免疫因子水平比较 与对照组比较，BV治疗组治疗前后IL-8水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组治疗前TNF-α及TLR2水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后各治疗组TNF-α和TLR2组间比较差异有统计学意义，B、D组TNF-α 和TLR2水平均低于A、C组（均P＜0.05）；A组与C组，B组与D组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。各治疗组治疗前后比较IL-8分泌水平无明显改变，TNF-α及TLR2水平治疗后均下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Immune factors level before and after treatment by different administration regimens表2 4种不同方法治疗前后免疫因子检测结果 （ng/L，±s）

Tab.2 Immune factors level before and after treatment by different administration regimens表2 4种不同方法治疗前后免疫因子检测结果 （ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与A组比较，c与B组比较，d与C组比较，P＜0.05

组别对照组A组B组C组n D组 F 25 23 22 22 23 IL-8治疗前141.79±1.48 141.15±1.38 141.19±1.60 141.26±1.81 141.83±2.10 0.99治疗后-141.36±2.10 141.30±1.84 141.46±2.02 141.64±2.58 0.12 t-t-t-1.08 0.44 0.41 0.32 TNF-α治疗前109.49±2.71 164.59±2.20a164.21±2.81a163.24±2.63a164.69±3.42a1 935.0＊＊治疗后-116.29±3.52 110.68±3.44b113.10±2.32c107.98±2.75bd35.60＊＊118.54＊67.95＊71.29＊77.68＊TLR2治疗前7.37±0.88 9.62±1.11a9.79±0.83a9.96±0.82a9.85±1.15a31.96＊＊治疗后-8.41±0.85 7.95±0.76b8.66±0.58c7.71±0.72bd8.60＊＊6.39＊9.23＊8.99＊9.30＊

3 讨论

3.1 不同给药方案治疗BV的疗效分析 BV是阴道内微生态失衡所引起的阴道黏膜炎症为表现的综合征，经典治疗方案为甲硝唑或克林霉素阴道局部或口服用药，治愈率可达70%～96%，然而治疗后7 d随访复发率高达49%～66%［7］。甲硝唑易诱发胃肠道不良反应、周围神经病变及假丝酵母菌的二重感染［8］。克林霉素的不良反应为抑制乳杆菌，导致菌群失调，诱发频繁的二重感染及复发。所以迫切需要更安全有效的替代治疗方法，不仅可以抑制阴道厌氧菌，并有助于恢复阴道微生态环境，减少复发及二重感染的可能。

本研究选取甲硝唑阴道泡腾片及硝呋太尔阴道片为研究药物，对比不同治疗方案对BV感染临床症状改善及阴道微生态恢复情况，结果显示硝呋太尔阴道片与甲硝唑阴道泡腾片疗效相似，序贯联合使用乳杆菌活菌胶囊给药方式优于单药使用。然而硝呋太尔阴道片在阴道微生态恢复方面略优于甲硝唑泡腾片。硝呋太尔是硝基呋喃类衍生物，具有广谱抗菌活性。BV治疗失败及难以根除的主要原因是诊断不完善、药物抵抗以及治疗后阴道菌膜形成［9］。加德纳菌属及阴道奇异菌属是构成阴道菌膜的主要菌群，硝呋太尔阴道片对这两种菌抵抗的活性强于甲硝唑［7］。本研究显示，甲硝唑阴道片或硝呋太尔阴道片联合乳杆菌活菌胶囊治疗方案在患者临床症状改善、阴道菌群多样性、菌群密集度、酶活性方面恢复率均高于单独使用甲硝唑阴道泡腾片或硝呋太尔阴道片，这与硝呋太尔不利于阴道细菌膜形成有关，联合应用乳杆菌活菌胶囊补充阴道中生理性乳杆菌数量，有助于乳杆菌在阴道内定植，抑制病原体的生长，恢复阴道正常微生态平衡。

3.2 不同治疗方案对BV患者阴道局部免疫环境的影响 近年来，阴道局部免疫环境变化与下生殖道感染的相关性备受重视。IL-8是中性粒细胞有效的趋化和激活因子，阴道分泌物中IL-8的水平与CD45+、CD3+细胞向炎症组织汇集密切相关［10］，可导致局部炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的目的。然而本研究结果显示，与对照组相比，BV患者阴道灌洗液中IL-8无显着差异，未导致局部白细胞增加，这与临床检查BV患者阴道局部无黏膜炎症表现、分泌物中白细胞稀少，白细胞酯酶呈阴性相一致。

近年研究发现BV感染可诱发多种性传播疾病，与HIV感染密切相关，细菌识别通路中Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）的激活在BV灌洗液诱导HIV TLR活化中起到了重要作用［11］。Zariffard等［12］已证实BV患者阴道灌洗液可以诱导TLR2 mRNA表达，导致TNF-α分泌水平增加，提高性传播疾病发生的概率。本研究证实，BV患者阴道灌洗液中TLR2、TNF-α均呈现高表达。给予4种方案治疗后TLR2及TNF-α的水平均下降，且甲硝唑阴道泡腾片或硝呋太尔阴道片联合乳杆菌活菌胶囊治疗后TLR2、TNF-α下降水平较单独用药明显，与临床症状及微生态恢复情况一致，故阴道微生态重建有利于阴道局部免疫环境的恢复。硝呋太尔阴道片对阴道免疫因子的调节作用与甲硝唑同等功效，且其抗菌谱更广，很少产生急、慢性不良反应，孕妇用药更安全。

本研究表明硝呋太尔阴道联合阴道微生态治疗效果最佳，可以获得较高的临床有效率，利用外源性乳杆菌调节阴道内正常菌群的共生比例，改善阴道的内环境及阴道局部免疫因子恢复方面也可获得满意疗效。该方案优于传统单药使用的效果，是目前治疗BV的良好选择，值得临床推广。但仍有待进一步监测复发率，评价孕期BV患者的用药剂量、疗效及安全性，为临床医生治疗BV提供更好的选择。

（图1见插页）

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（2016-03-14收稿 2016-05-29修回）

（本文编辑 魏杰）

Influence of different administration regimens for treatment of bacterial vaginosis on vaginal microflora and the expression of immune factors

WANG Fang1，HUO Yan2，LIU Yanyan3，YIN Lirong1△
1 Department of Gynecology，2 Department of Family Planning，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China；3 Department of Gynecology，Tianjin Huaxing Hospital△

Objective Tracking of the vaginal microflora recovery and the expression of immune factors from untreated and treated patients with bacterial vaginosis（BV）by using different administration regimens and studying the relationship of treatment results and regimen selections.Methods 25 healthy females were selected as a control group and 100 BV patients were randomly divided into 4 groups（n=25/group）.Group A:Intravaginal administration of metronidazole（×7 d），Group B:Continuous intravaginal administration of metronidazole（×7 d）and then live Lactobacillus Capsule（×7 d），Group C:Intravaginal administration of nifuratel（×7 d），Group D:Continuous intravaginal administration of nifuratel（×7 d）and then live Lactobacillus Capsule（×7 d）.The microecological assessment system and EILSA were used to compare the clinical efficacy，vaginal microflora recovery and the changes in IL-8，TLR2 and TNF-α of the vaginal lavage fluid in healthy women or patients with bacterial vaginosis before and after treatments by four treatment strategies.Results ① The vaginal microflora imbalance，flora disturbance，pH value increased were presented in BV group compared with the control group.②Compared to the median of IL-8，TLR2 and TNF-α in vaginal lavage fluids of control group，there was no significant difference in IL-8 level but both TLR2 and TNF-α were significantly increased（P＜0.05）in BV group.The immune factors had no significantly difference in all BV groups.③The therapeutic effect in each BV groups was compared after stopping treatment for 7 days.The cure rate and the vaginal microflora recovery rate were significant higher in group B and D than group A and C（P＜0.05）.④After treatment there was no significant change in IL-8 level but there was an obviouslydecrease in TLR2 and TNF-α（P＜0.05）.The decreased levels are more significant in groups B and D than groups A and C （P＜0.05）.Conclusion By combining with the microecological assessment system to evaluate the therapeutic effect of BV，our research suggests that the sequence schemes of nifuratel plus live Lactobacillus Capsule is more effective in therapy effect，restoring normal vaginal micro-ecological environment and vaginal local immunity than metronidazole used alone.

vaginosis，bacterial；lactobacillus；metronidazole；nifuratel；interleukin-8；toll-like receptor 2；tumor necrosis factor-alpha

R711.73

A

10.11958/20160162

天津市卫生局科技基金（2012KZ094）

1天津医科大学第二医院妇科（邮编300211），2计划生育科；3天津华兴医院妇产科

王芳（1976），女，主治医师，博士，主要从事女性生殖道感染及宫颈肿瘤研究

△通讯作者 E-mail：yinlirongfk@sina.com