肿瘤相关巨噬细胞通过激活IGF-1R信号通路诱导三阴性乳腺癌细胞对白蛋白紫杉醇耐药的研究

刘淑娟，刘梦莹，苏乌云，窦佳，王薇△

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种生长迅速的侵袭性乳腺癌，化疗是TNBC的最主要的治疗手段［1］。白蛋白紫杉醇（Nabpaclitaxel，Nab-PTX）是一种无溶剂的紫杉醇新剂型［2］，已成为TNBC 治疗的一线用药，其疗效及安全性均优于普通紫杉醇制剂［3］。但随着治疗的进行，对Nab-PTX 耐药的问题也逐步凸显。寻找逆转TNBC 耐药的新靶点和治疗方法是目前研究的热点与难点。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中一类重要的免疫细胞，多呈现M2表型特征［4］。研究证实TAM在乳腺癌中占基质细胞的50%~80%［5］，与TNBC 耐药有关［6］，但TAM 介导的TNBC 耐药的分子机制尚未完全明确。胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）是一种酪氨酸蛋白激酶受体［7］，IGF-1R 抑制剂可逆转肿瘤细胞耐药性，提高疗效［8-9］。TAM 可否通过激活IGF-1R 促进TNBC 细胞对Nab-PTX 耐药性尚不清楚。本研究建立M2型巨噬细胞模拟TAM，将TNBC细胞与M2型巨噬细胞共培养，探讨TAM 是否通过激活IGF-1R 信号通路促进TNBC 细胞对Nab-PTX 耐药，为耐药患者寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 TNBC细胞系MDA-MB-231、单核细胞系THP-1均购自广州莱德联康生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640 培养基、青链霉素均购自美国Hyclone公司；RNA 提取试剂盒购自美国Qiagen 公司；反转录试剂盒及RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning 公司；CCK-8 细胞增殖检测试剂盒及细胞凋亡检测试剂盒购自美国Keygen 公司；APC 标记鼠抗人CD14及其同型抗体、PE标记的鼠抗人CD206及其同型抗体、IGF-1R、p-IGF-1R、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p-ERK、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT 和GAPDH一抗及山羊抗鼠IgG二抗均购自英国Abcam公司；佛波酯（PMA）购自美国MCE公司；白细胞介素（IL）-4、IL-13购自美国RD公司；IGF-1R抑制剂Linsitinib购自维百奥（北京）生物科技有限公司；白蛋白结合型紫杉醇购自中国石药集团欧意药业有限公司。酶标仪购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；电泳仪购自北京百晶生物技术有限公司；流式细胞仪购自美国BD Biosciences 公司；实时荧光定量PCR（qPCR）仪购自美国ABI 公司；倒置光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231、THP-1 细胞均接种于含100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素和10%FBS的RPMI-1640基础培养基，置于含5% CO2、37 ℃的湿化培养箱中常规培养。

1.2.2 M2型巨噬细胞的诱导建立 取对数生长期的THP-1细胞，离心收集细胞，先用PMA（185µg/L）刺激THP-1 细胞48 h，诱导THP-1 细胞分化成M0 型巨噬细胞，再加入IL-4（20 µg/L）和IL-13（20 µg/L）处理48 h，诱导细胞向M2 型巨噬细胞极化［10］。

1.2.3 流式细胞术鉴定细胞表面标记分子CD14、CD206 的表达 将诱导后的细胞消化、重悬于PBS 中，调整细胞密度约为1×106个/mL。室温孵育15 min，加入CD14抗体（20µL）和CD206抗体（20µL），对照组加入等体积的同型对照抗体，室温避光孵育30 min，离心、洗涤细胞，再用PBS 重悬细胞，迅速移至流式细胞仪上机检测。

1.2.4 qPCR 检测巨噬细胞IL-10、趋化因子配体2（CCL2）mRNA的表达 采用Trizol法提取不同诱导条件下巨噬细胞的总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，按说明书进行扩增，引物序列由广州莱德联康生物科技有限公司合成。IL-10：上游5'-CTTCAGCAGAGTGAAGACTT-3'，下游5'-GGAT CATCTCAGACAAGGCT-3'，产物大小122 bp；CCL2：上游5'-CCAGATGCAATCAATGCCCC-3'，下游5'-GGGACACTTGCT GCTGGTGA-3'，产物大小108 bp；内参GAPDH：上游5'-GCTCATTTGCAGGGGGGAG-3'，下游5'-GTTGGTGGTGCAG GAGGCA-3'，产物大小138 bp。反应条件：95 ℃预变性120 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火32 s，共40个循环。各组实验重复3次，采用2-ΔΔCt方法分析mRNA相对表达量。

1.2.5 M2型巨噬细胞与MDA-MB-231细胞共培养体系的建立及分组 将5×105个MDA-MB-231细胞接种至24孔板，细胞贴壁后，将0.4 µm 的Transwell 小室移入24 孔板中，并将THP-1诱导生成的1×105个M2型巨噬细胞接种于小室上层，共培养48 h，收集下层MDA-MB-231 细胞，用于后续实验［11］。对照组：MDA-MB-231 细胞及空白小室；Nab-PTX组：MDA-MB-231 细胞、空白小室及0.5 nmol/L Nab-PTX；TAM 组：MDA-MB-231 细胞、含M2 型巨噬细胞的小室；TAM+Nab-PTX 组：MDA-MB-231 细胞、含M2 型巨噬细胞的小室及0.5 nmol/L Nab-PTX；IGF-1R 抑制剂组：MDA-MB-231 细胞、含M2 型巨噬细胞的小室、0.5 nmol/L Nab-PTX 及4 nmol/L IGF-1R抑制剂Linsitinib。

1.2.6 CCK-8 法检测MDA-MB-231 细胞的增殖 稀释各组细胞，以1×104个/孔的密度接种到96 孔板，待细胞贴壁生长后加入Nab-PTX或IGF-1R抑制剂，继续培养48 h，每组接种5 个复孔。加10µL CCK-8（1∶10）至待测孔中，孵育4 h，酶标仪读板，测定490 nm 处的光密度（OD）值，代表细胞增殖水平。

1.2.7 流式细胞术检测MDA-MB-231 细胞凋亡 收集待测细胞，消化、重悬，加入1.25 µL Annexin V-FITC 和10 µL PI溶液，室温避光反应15 min。离心，弃上清，缓冲液重悬细胞。流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。

1.2.8 qPCR 检测MDA-MB-231 细胞多药耐药蛋白（MDR）1和胱天蛋白酶（Caspase）-3 mRNA 表达 采用Trizol 法提取各组细胞中总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，按说明书进行扩增，引物序列由广州莱德联康生物科技有限公司合成。MDR1：上游5'-GCTTAACACCCGACTTACAG-3'，下游5'-CAACCACGTGTAAATCCTACT-3'，产物大小126 bp；Caspase-3：上游5'-ATGATCTTACACGTGAAGAA-3'，下游5'-CTTCACCATGGCTCAGAAGC-3'，产物大小105 bp；内参GAPDH：上游5'-GCTCATTTGCAGGGGGGAG-3'，下游5'-GTTGGTGGTGCAGGAGGCA-3'，产物大小138 bp。反应条件：95 ℃预变性120 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火32 s，共40个循环。各组实验重复3次，采用2-ΔΔCt方法对mRNA相对表达量进行分析。

1.2.9 Western blot 检测MDA-MB-231 细胞IGF-1R 信号通路关键蛋白表达 各组分别取2×106个细胞，用SDS 裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。配置10%分离胶和5%浓缩胶，取30 µg 蛋白进行10%SDS-PAGE 电泳后转至PVDF 膜，封闭后，加p-IGF-1R、IGF-1R、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后用增强化学发光（ECL）荧光试剂显影。GAPDH设为内参，使用Image J 软件对Western 印迹进行灰度值分析，计算每组蛋白相对表达量，测量重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行数据分析，计量资料以表示。2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，使用Tukey-q法进行组间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAM的鉴定

2.1.1 巨噬细胞表面标志物表达特征 流式细胞仪分析显示，THP-1 细胞经过PMA 刺激后分化成为M0 巨噬细胞，其表面分子CD14 阳性表达率为（6.97±0.31）% ，CD206 的阳性表达率为（5.64±0.50）%；继续给予IL-4和IL-13刺激后，诱导分化生成的M2 型巨噬细胞CD14 阳性表达率为（59.89±1.01）%，CD206 阳性表达率为（62.7±1.97）%，符合M2型巨噬细胞的特征，见图1。

Fig.1 The characteristics of cell surface markers CD14 and CD206 in TAM图1 TAM表面标志物CD14、CD206的表达特征

2.1.2 不同诱导条件下巨噬细胞IL-10 mRNA 及CCL2 mRNA 表达水平 qPCR 结果显示，M2型巨噬细胞内IL-10 mRNA 水平与M0 型巨噬细胞相比明显升高（3.47±0.15vs. 1.00±0.02，n=6，t=28.270，P＜0.01）；M2 型巨噬细胞内CCL2 mRNA 水平与M0 型巨噬细胞相比明显升高（6.38±0.19vs.0.91±0.18，n=6，t=35.960，P＜0.01）。

2.2 TAM对Nab-PTX干预MDA-MB-231细胞增殖的影响 CCK-8 结果显示，与对照组和TAM 组相比，Nab-PTX 组24、48 和72 h 细胞增殖水平下降（P＜0.01）；与Nab-PTX 组相比，TAM+Nab-PTX 组24、48和72 h细胞增殖水平升高（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between four groups表1 4组MDA-MB-231细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD490，）

Tab.1 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between four groups表1 4组MDA-MB-231细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD490，）

＊＊P＜0.01；a 与对照组比较，b 与Nab-PTX 组比较，P＜0.05。表3、4同。

组别对照组Nab-PTX组TAM组TAM+Nab-PTX组F 24 h 0.470±0.002 0.440±0.002a 0.510±0.002b 0.460±0.002b 716.879＊＊48 h 0.630±0.001 0.540±0.004a 0.720±0.001b 0.610±0.003b 2 090.309＊＊72 h 0.770±0.004 0.620±0.003a 0.930±0.006b 0.760±0.006b 2 276.647＊＊

2.3 TAM对Nab-PTX干预MDA-MB-231细胞凋亡的影响 流式细胞术检测显示，对照组、Nab-PTX组、TAM 组和TAM+Nab-PTX 组细胞凋亡率（%）分别为5.81±0.10、20.21±2.54、2.06±0.91和12.68±0.51，组间比较差异有统计学意义（n=3，F=79.338，P＜0.01）。与对照组相比，Nab-PTX组细胞凋亡率升高（P＜0.01）；与Nab-PTX 组相比，TAM+Nab-PTX 组细胞凋亡率降低（P＜0.01），见图2。

Fig.2 Effects of TAM on apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by Nab-PTX图2 TAM对Nab-PTX干预MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.4 IGF-1R 抑制剂对TAM 诱导的MDA-MB-231细胞耐药的影响 CCK-8 结果显示，与TAM+Nab-PTX 组相比，IGF-1R 抑制剂组24、48 和72 h 细胞增殖水平均降低（P＜0.01），见表2。流式细胞实验结果显示，与TAM+Nab-PTX 组相比，IGF-1R 抑制剂组MDA-MB-231 细胞凋亡率（%）增高（23.09±0.86vs.12.71±0.62，n=3，t=16.893，P＜0.01），见图3。

Tab.2 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between two groups表2 2组MDA-MB-231细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD490，）

Tab.2 Comparison of proliferation of MDA-MB-231 cells at different time points between two groups表2 2组MDA-MB-231细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD490，）

＊＊P＜0.01。

组别TAM+Nab-PTX组IGF-1R抑制剂组t 24 h 0.460±0.002 0.420±0.001 19.290＊＊48 h 0.610±0.003 0.500±0.003 42.832＊＊72 h 0.760±0.006 0.560±0.003 45.987＊＊

Fig.3 Effects of IGF-1R inhibitors on apoptosis of MDA-MB-231 cells co-cultured with TAM图3 IGF-1R抑制剂对TAM共培养MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.5 TAM 对Nab-PTX 干预MDA-MB-231 细胞中MDR1 和Caspase-3 mRNA 的表达影响 qPCR 结果显示，与对照组相比，Nab-PTX 组MDA-MB-231 细胞内MDR1 mRNA 水平降低，Caspase-3 mRNA 水平升高（P＜0.01）；与Nab-PTX组相比，TAM+Nab-PTX组MDR1 mRNA 水平升高，Caspase-3 mRNA 水平降低（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of MDR1 mRNA and Caspase-3 mRNA expression between four groups of MDA-MB-231 cells表3 4组MDA-MB-231细胞MDR1和Caspase-3 mRNA表达的比较（n=3，）

Tab.3 Comparison of MDR1 mRNA and Caspase-3 mRNA expression between four groups of MDA-MB-231 cells表3 4组MDA-MB-231细胞MDR1和Caspase-3 mRNA表达的比较（n=3，）

＊＊P＜0.01。

组别对照组Nab-PTX组TAM组TAM+Nab-PTX组F MDR1 1.00±0.03 0.29±0.01a 1.72±0.61 0.83±0.03b 934.279＊＊Caspase-3 1.00±0.02 2.03±0.04a 0.58±0.40 1.20±0.02b 21.360＊＊

2.6 TAM 对Nab-PTX 干预MDA-MB-231 细胞中IGF-1R 信号通路关键蛋白表达影响 Western blot结果显示，与对照组比较，Nab-PTX组p-IGF-1R、p-AKT及p-ERK均降低，TAM组p-IGF-1R、p-AKT及p-ERK 均升高（P＜0.01）；与Nab-PTX 组比较，TAM+Nab-PTX 组中p-IGF-1R、p-AKT 及p-ERK 均升高（P＜0.01），见表4、图4。

Tab.4 Comparison of protein expression levels of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK between MDA-MB-231 cells of each group表4 各组MDA-MB-231细胞内p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK蛋白表达水平比较 （n=6，）

Tab.4 Comparison of protein expression levels of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK between MDA-MB-231 cells of each group表4 各组MDA-MB-231细胞内p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK蛋白表达水平比较 （n=6，）

＊＊P＜0.01。

组别对照组Nab-PTX组TAM组TAM+Nab-PTX组F p-IGF-1R/IGF-1R 1.030±0.001 0.400±0.002a 1.300±0.004ab 0.980±0.008b 17 108.381＊＊p-AKT/AKT 0.780±0.001 0.460±0.003a 0.960±0.002ab 0.740±0.004b 13 656.675＊＊p-ERK/ERK 0.980±0.007 0.570±0.002a 1.320±0.002ab 0.770±0.013b 5 499.251＊＊

Fig.4 The protein expression levels of IGF-1R,p-IGF-1R,AKT,p-AKT,ERK and p-ERK in each group图4 Western blot检测各组MDA-MB-231细胞内IGF-1R、p-IGF-1R、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白表达

2.7 IGF-1R 抑制剂对MDA-MB-231 细胞MDR1 mRNA 和Caspase-3 mRNA 的表达的影响 IGF-1R抑制剂组MDA-MB-231 细胞内MDR1 mRNA 水平（0.39±0.02）与TAM+Nab-PTX 组（1.00±0.04）相比降低（n=3，t=23.625，P＜0.01），IGF-1R 抑制剂组Caspase-3 mRNA水平（3.05±0.08）与TAM+Nab-PTX组（1.00±0.03）相比升高（n=3，t=31.973，P＜0.01）。

2.8 IGF-1R 抑制剂对MDA-MB-231 细胞IGF-1R信号通路关键蛋白的表达影响 与TAM+Nab-PTX组相比，IGF-1R 抑制剂组MDA-MB-231 细胞内p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK 的表达明显降低（P＜0.01），见表5、图5。

Tab.5 Comparison of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK rations between the two groups of cells表5 2组细胞内p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK比较（n=6，）

Tab.5 Comparison of p-IGF-1R,p-AKT and p-ERK rations between the two groups of cells表5 2组细胞内p-IGF-1R、p-AKT、p-ERK比较（n=6，）

＊＊P＜0.01。

组别TAM+Nab-PTX组IGF-1R抑制剂组t p-IGF-1R/IGF-1R 1.280±0.014 0.500±0.009 77.249＊＊p-AKT/AKT 1.120±0.020 0.450±0.002 57.151＊＊p-ERK/ERK 0.860±0.006 0.420±0.001 119.965＊＊

Fig.5 Western blot assay of the TAM+Nab-PTX group and the IGF-1R inhibitor group图5 TAM+Nab-PTX组和IGF-1R抑制剂组蛋白表达印迹图

3 讨论

Nab-PTX 是治疗TNBC 的常用药物之一，但易产生化疗耐药。目前研究聚焦于肿瘤微环境中各类细胞在耐药中的作用。在复杂的肿瘤微环境中，巨噬细胞可以被募集到肿瘤区域，并被极化为M1 或M2 型，然而TAM 主要表现出M2 样极化状态［12］，具有免疫抑制作用，同时细胞内表达相对较高的IL-10、CCL2 水平［5，13］。研究发现，TAM 在体外和体内都能通过激活NF-κB信号减弱药物对TNBC细胞的杀伤作用，减少肿瘤细胞的凋亡［14］。本研究结果显示，与Nab-PTX 组相比，TAM+Nab-PTX 组细胞增殖率升高、凋亡率下降，与上述研究［14］结果相似，说明TAM 可降低MDA-MB-231 细胞对Nab-PTX 敏感性，具有保护肿瘤细胞的作用。因此，寻找TAM 保护肿瘤细胞的机制对逆转TNBC耐药至关重要。

MDR1 可将进入细胞内的药物泵出细胞外，降低药物在细胞内的生物利用度，进而引发细胞耐药［15］。本研究中，与Nab-PTX 组相比，TAM+Nab-PTX组MDA-MB-231细胞内MDR1 mRNA表达量均升高，凋亡相关因子Caspase-3 mRNA 表达均降低，提示TAM 可能通过MDR1 降低药物在细胞内的生物利用度和抑制细胞凋亡级联反应，进而降低MDA-MB-231 细胞对Nab-PTX 的化疗敏感性。IGF-1R 作为IGF 系统中重要的受体，与IGF1 和IGF2 结合后，触发其酪氨酸激酶结构域的转磷酸化，激活下游的AKT和ERK通路，诱导细胞增殖、抑制细胞凋亡［16］。Ireland等［17］对浸润性乳腺癌患者的活检组织进行免疫组织化学染色，结果显示，M2 型巨噬细胞包围的肿瘤细胞中p-IGF-R 水平增加，51例TNBC 患者中有45 例（88.2%）表现出IGF-1R 激活。Davison 等［18］发现IGF-1 通过激活AKT 和ERK通路增强体外TNBC细胞的增殖，IGF-1R/胰岛素受体（IR）酪氨酸激酶抑制剂可改善TNBC 细胞耐药。Liu等［19］发现，AKT和ERK通路参与MDR1表达的调控，AKT 及ERK 阻断剂能抑制TNBC 细胞内MDR1 mRNA 的上调。本研究中TAM 组和TAM+Nab-PTX组MDA-MB-231 细胞中的IGF-1R 及下游ERK 和AKT信号通路被激活，提示TAM可能通过激活IGF-1R及下游AKT和ERK信号通路提高MDR1的表达，下调Caspase-3 表达，降低MDA-MB-231 细胞对Nab-PTX 的化疗敏感性。本研究还发现IGF-1R 抑制剂可以提高Nab-PTX 对TAM 共培养MDA-MB-231细胞的杀伤作用，为进一步评估IGF-1R 抑制剂联合Nab-PTX治疗TNBC提供了理论依据。

综上所述，TAM 可引起TNBC 细胞对Nab-PTX耐药，其机制可能与TAM 激活肿瘤细胞内IGF-1R及下游AKT和ERK信号通路有关，提示靶向TAM或阻断肿瘤细胞中的IGF-1R 是一种有潜力的耐药治疗策略。该结论未在动物体内进行验证，是否还有其他信号通路参与，需后续深入研究。