枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡肠道免疫、肠道组织形态以及肠道屏障的影响

秦士贞,杨敏敏,任志雄,李金录,唐德富,史兆国

(甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州 730070)

动物肠道是营养物质消化吸收的重要场所,也是全身最大的免疫器官,肠道健康与动物生产性能的优劣和养殖经济效益息息相关[1]。动物生产中使用的约70%～80%的治疗性抗生素被用于治疗肠道疾病。因此,维持良好的肠道健康是现代动物生产中的主要挑战。肉鸡高密度集约化的养殖方式加之其胆小易受惊吓的生理特征导致机体易产生免疫应激,引起肠道上皮细胞破损,肠道形态发生改变、肠道通透性增加以及肠道黏膜屏障受损,破坏肠道健康,进而影响肉鸡生产[2]。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,BS)是一种能够产生抗逆性内生孢子的需氧革兰阳性菌[3],是我国允许在饲料端直接饲喂的饲用益生菌之一,具有极强的抗逆性及较高的稳定性,能很好的在肠道中存活、定植[4]。研究表明,枯草芽孢杆菌作为一种优质、安全且目前应用最广泛的饲用益生菌之一,具有提高动物生产性能、增强机体免疫及抗氧化功能、缓解热应激和维护家禽肠道健康等多种功能[5-6]。研究表明,在饲粮中添加BS可以改善肉鸡生长性能,提高肉鸡平均日增重、降低料肉比,在热应激条件下,BS可以促进老化肠黏膜的恢复和修复[7-8]。本实验室前期采用生产中常见的应激源脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建肉鸡应激模型,研究了BS对生产性能等指标的影响,结果表明,在免疫应激条件下,肉鸡饲粮中添加BS可缓解应激造成的肉仔鸡生长性能降低,改善血清抗氧化性能,抑制血清炎性细胞因子含量的增加,进而增强机体免疫力,从而减轻应激对动物机体造成的损伤[9]。本试验在前期研究基础上,继续利用LPS建立应激模型,进一步研究饲粮中添加BS对肠道免疫因子、肠道形态以及肠道屏障相关基因表达的影响,旨在探究BS对肉仔鸡肠道的保护作用,为BS在家禽生产中预防及缓解应激的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BS(活菌数≥5.0×109CFU·g-1)购自福建中基生物工程有限公司;LPS(来源于大肠杆菌,血清型O55:B5)购自北京索莱宝科技有限公司;1日龄爱拔益加(AA)肉鸡购自西安大成禽业有限公司。

1.2 试验设计与处理

采用2×2两因子安排的完全随机设计,两因子分别为:日粮处理(基础日粮或基础日粮添加200 g·t-1BS的试验日粮)和应激处理(口腔灌服LPS或等量生理盐水)。即试验分为:1)基础日粮+生理盐水组;2)基础日粮+LPS组;3)试验日粮+生理盐水;4)试验日粮+LPS组。

1.3 试验动物及管理

选用1日龄爱拔益加(AA)肉鸡240只(公母各半),随机分成4个处理组,每个处理6个重复,每个重复10只鸡。试验采用3层笼养,分3个阶段:包括应激前期(第1～14天)、LPS应激期(第15～21天)和恢复期(第22～28天),为期28 d。于试验第14、16、18、20天早晨8:00空腹,对基础日粮和试验日粮组其中的一半肉仔鸡用注射器进行口腔灌服LPS溶液(500 μg·kg-1BW),同时对基础日粮和试验日粮组中另外一半肉仔鸡用注射器进行口腔灌服等量的生理盐水。饲养管理和常规免疫按照《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。采用24 h恒定光照,鸡只自由采食、饮水。按照常规免疫程序定期进行免疫接种。

1.4 试验日粮

基础日粮参照NRC(1994)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制玉米-豆粕型日粮,其组成及营养水平见表1。

1.5 样品采集

分别于试验第21和28日龄,从每个处理组随机选取6只鸡(公母各半,每重复1只鸡)。颈部放血处死,迅速剖开腹腔,分离出十二指肠、空肠和回肠,分别取各肠段中段约1～2 cm,用生理盐水将肠道内食糜冲洗干净,放入4%的多聚甲醛溶液中固定保存,将固定好的肠道组织送至武汉塞维尔生物科技有限公司制作组织切片,组织切片的制作参考孙晓[10]的方法。同时,取剩余的十二指肠、空肠和回肠,用生理盐水冲洗肠道食糜内容物,冰浴上用灭菌的载玻片刮取肠黏膜放于无RNA酶的冻存管中,放入液氮中暂存,之后转移至-80 ℃冰箱保存,用于测定mRNA的相对表达量。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 肠道形态结构测定 将制作好的组织切片放置在显微镜下,每张切片选取走向良好的6个视野,采用Motic-BA210Digital数码显微镜测量绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD),并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)。

1.6.2 肠道组织中免疫相关因子以及肠道屏障相关基因mRNA测定 按试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书步骤提取各肠道总RNA,用微量紫外可见分光光度计(NanoDrop2000)测定RNA浓度和纯度。参照反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT re-agent Kitwith gDNA Eraser)说明书对总RNA进行反转录合成cDNA,储存在-20 ℃冰箱中备用。利用Light Cycler 480Ⅱ Systems荧光定量基因扩增仪,采用SYBR GreenI染料法,以肌动蛋白(beta actin,β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为双内参,参照SYBR® Green ProTaq HS预混型qPCR试剂盒(湖南艾克瑞生物工程有限公司)进行实时荧光定量PCR扩增,用2-△△Ct法计算基因表达量。目的基因为:白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis actor-α,TNF-α);白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6);白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10);Toll样受体4 (Toll like rececptor 4,TLR4);髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88);核转录因子-κB(nuclear factor kappa,NF-κB);闭锁蛋白(Occludin);紧密连接蛋白1(Zonulaoccludons-1,ZO-1);闭合蛋白1(Claudin-1);黏蛋白2(MUC2),引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成,详见表2。

1.7 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010软件进行初步整理,利用SPSS 26.0统计软件中的一般线性模型(general linear models, GLM)进行两因子方差分析,每个重复作为1个试验单元,主效应包括饲粮和LPS应激以及两者互作。方差分析差异显着时用Duncan氏法进行多重比较,所有数据均以P<0.05作为显着性检验的标准,试验结果用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。

2 结 果

2.1 BS对LPS肉仔鸡肠道中免疫相关基因mRNA表达量的影响

2.1.1 BS对LPS应激肉仔鸡十二指肠中免疫相关基因mRNA表达量的影响 由表3可知,在第21天,日粮添加BS与LPS应激对肉仔鸡十二指肠IL-1β、TLR4 mRNA的表达量有显着的交互作用(P<0.05)。无LPS应激条件下,与基础日粮组相比,日粮添加BS对IL-1β、TLR4 mRNA的表达量无显着差异(P> 0.05);而在LPS应激条件下,BS日粮组显着下调了IL-1β和TLR4 mRNA的表达量(P<0.05)。LPS应激显着提高了IL-6、TNF-α、NF-κB、MyD88 mRNA的表达(P<0.05)。由表4可知,在第28天,日粮添加BS与LPS应激对基因TLR4和NF-κBmRNA的表达有显着交互作用(P<0.05)。在无LPS应激条件下,与基础日粮组相比,BS日粮组对TLR4和NF-κBmRNA的表达量无显着影响(P> 0.05);在LPS应激条件下,BS日粮组显着降低了TLR4和NF-κBmRNA的表达(P<0.05)。LPS应激显着增加了TNF-αmRNA的表达量(P<0.05)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2.1.2 BS对LPS应激肉仔鸡空肠中免疫相关基因mRNA表达量的影响 由表5可知,在第21天,日粮中添加BS与LPS应激对空肠MyD88 mRNA的表达有显着的交互作用(P<0.05)。在无LPS应激条件下,与基础日粮组相比,日粮中添加BS对MyD88 mRNA的表达无显着影响(P>0.05);在LPS应激条件下,BS日粮组中MyD88 mRNA的表达量着降低(P<0.05)。LPS应激显着增加了IL-1β、TNF-α、NF-κBmRNA的表达丰度(P<0.05)。由表6可知,在试验第28天,BS日粮与LPS应激及两者交互作用对空肠中免疫相关因子mRNA的表达均无显着影响(P>0.05)。

2.1.3 BS对LPS应激肉仔鸡回肠中免疫相关基因mRNA表达量的影响 由表7可知,在第21天,BS日粮与LPS应激对回肠TNF-αmRNA的表达有明显的交互作用(P<0.05)。在无LPS应激条件下,基础日粮组添加BS对TNF-αmRNA的表达无显着影响(P>0.05);在LPS应激条件下,BS日粮显着下调了TNF-αmRNA的表达(P<0.05)。LPS应激显着提高了IL-1β、NF-κB和MyD88 mRNA的表达量(P<0.05)。由表8可知,在第28天,BS日粮与LPS应激以及两者交互作用对回肠中免疫相关基因mRNA的表达均无显着影响(P>0.05)。

表3 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第21天十二指肠中免疫相关基因表达量的影响Table 3 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in duodenum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 21st day

表4 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第28天十二指肠中免疫相关基因表达量的影响Table 4 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in duodenum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

表5 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第21天空肠中免疫相关基因表达量的影响

表6 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第28天空肠中免疫相关基因表达量的影响Table 6 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

2.2 BS对LPS应激肉仔鸡小肠形态结构的影响

2.2.1 BS对LPS应激肉仔鸡十二指肠形态结构的影响 由表9可知,在第21天,日粮中添加BS与LPS应激对十二指肠VH及V/C的比值有显着性交互作用(P<0.05)。无论有无LPS应激,与基日粮组相比,日粮中添加BS可显着提高VH及V/C的比值(P<0.05)。LPS应激显着增加了CD(P<0.05)。在第28天,BS日粮与LPS应激对VH、CD及V/C的比值均无显着性交互作用(P>0.05)。与基础日粮组相比,BS日粮显着提高了VH及V/C的比值(P<0.05)。LPS应激显着降低VH及V/C的比值(P<0.05)。BS和LPS对CD均无显着影响(P>0.05)。

表7 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第21天回肠免疫相关基因表达量的影响

表8 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡第28天回肠免疫相关基因表达量的影响Table 8 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in ileum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

2.2.2 BS对LPS应激肉仔鸡空肠形态结构的影响 由表10可知,在第21天,BS日粮与LPS应激对空肠CD有显着性交互作用(P<0.05)。在无LPS应激条件下,BS日粮组空肠的CD显着的低于基础日粮组(P<0.05);在LPS应激条件下,基础日粮组添加BS对CD无显着影响(P>0.05)。与基础日粮组相比,BS日粮组显着提高了VH和V/C的比值(P<0.05)。LPS应激显着降低了VH和V/C的比值(P<0.05)。在第28天,BS日粮与LPS应激对VH和V/C的比值有显着的交互作用(P<0.05)。在无LPS应激条件下,BS日粮组与基础日粮对VH和V/C的比值均无显着影响(P>0.05);在LPS应激条件下,BS日粮组较基础日粮组显着增加了VH和V/C的比值(P<0.05)。

表9 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡十二指肠形态结构的影响Table 9 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in duodenal of broilers challenged with lipopolysaccharide

表10 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡空肠形态结构的影响Table 10 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.2.3 BS对脂多糖应激肉仔鸡回肠形态结构的影响 由表11可知,在第21天,BS日粮与LPS应激对回肠VH、CD和V/C的比值均无显着交互作用(P>0.05)。LPS应激显着降低了VH和V/C的比值(P<0.05),对CD无显着影响(P>0.05)。在第28天,BS日粮与LPS应激及两者互作对VH、CD和V/C的比值均无显着影响(P>0.05)。

表11 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡回肠形态结构的影响Table 11 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in ileum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3 BS对LPS应激肉仔鸡肠道屏障相关基因表达的影响

2.3.1 BS对LPS应激肉仔鸡十二指肠紧密连接蛋白mRNA表达的影响 由表12可知,在整个试验期,BS日粮与LPS应激对十二指肠Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量均无显着交互作用(P>0.05)。在第21天,与基础日粮组相比,BS日粮显着提高了Occludin、ZO-1的mRNA的表达量(P<0.05)。LPS应激显着降低了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2的mRNA表达量(P<0.05)。在第28天,BS日粮与LPS应激以及两者交互对上述指标均无显着性影响(P>0.05)。

表12 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡十二指肠紧密连接蛋白mRNA表达量的影响Table 12 Effects of Bacillus subtilis on gene expression of intestinal barrier in duodenal of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3.2 BS对LPS应激肉仔鸡空肠紧密连接蛋白mRNA表达的影响 由表13可知,在整个试验期,BS日粮与LPS应激对空肠Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量无显着交互作用(P>0.05)。在第21天,BS日粮组较基础日粮组显着提高了Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量(P<0.05),对Claudin-1 mRNA的表达无显着影响(P>0.05)。LPS应激显着降低了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量(P<0.05)。在第28天,在LPS应激下,肉鸡空肠中MUC2 mRNA的表达量显着降低(P<0.05)。

表13 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡空肠紧密连接蛋白mRNA表达量的影响Table 13 Effects of Bacillus subtilis on gene expression of intestinal barrier in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3.3 BS对LPS应激肉仔鸡回肠紧密连接蛋白mRNA表达的影响 由表14可知,在整个试验期,BS日粮与LPS应激两者的交互作用对回肠黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达无显着影响(P>0.05)。在第21天,LPS应激显着下调了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量(P<0.05)。在第28天,ZO-1 mRNA的表达量在BS日粮组中显着高于基础日粮组(P<0.05)。LPS应激对上述指标无显着影响(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 BS对LPS应激肉仔鸡肠道免疫相关基因的影响

研究表明,LPS可通过增加促炎细胞因子的水平使肉仔鸡处于免疫应激状态[11]。大量研究表明,LPS应激显着提高肉鸡肠道IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达量[12-15]。李昆[16]研究发现,LPS应激显着提高了肉仔鸡十二指肠、空肠中TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOSmRNA的表达量,显着提高了回肠中MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、iNOSmRNA的表达量。本试验结果表明,在LPS应激条件下,肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠中IL-1β、TNF-α、NF-κB、MyD88以及十二指肠IL-1β和TLR-4 mRNA的表达量均显着升高,而饲粮中添加BS显着降低了上述基因的表达,这表明饲粮中添加BS可抑制LPS应激诱导的炎症反应。其原因可能是BS作为非特异性的免疫因子,在体内具有一定的免疫调节活性,可以激活巨噬/单核细胞,刺激宿主建立完整的免疫系统[6]。TLR4是一种模式识别受体,可识别多种病原体相关的分子模式,启动下游信号转导途径,激活体内NF-κB途径,介导炎性细胞因子基因表达,进而使机体产生免疫应答反应。本试验发现,在LPS应激条件下,TLR4在十二指肠中过表达,TLR4下游信号分子MyD88和NF-κB在不同肠道中的表达量也显着升高,导致肠道中炎性物质增多,造成肠道损伤,这一结果与上述研究一致。本试验还发现,在LPS应激条件下,日粮中添加BS显着降低了TLR4、MyD88和NF-κB基因的过表达,且BS日粮与LPS应激对不同肠道中免疫相关基因的表达量均有显着的交互作用,说明BS通过抑制TLR4的过表达,抑制了LPS与跨膜受体的结合,使LPS不能将细胞外信号转导至细胞内,无法介导其下游信号通路激活,进而减少对机体造成损伤。此外,芽孢杆菌可以改善肠道内微生态环境,增强肠道屏障功能,减少肠道中内外抗原,降低抗原(如LPS)与炎症通路上的特异性受体TLR4结合,减少TLR4的活化,进而抑制NF-κB核移位诱导产生促炎细胞因子,减少炎症反应的发生[17-19]。

3.2 BS对LPS应激肉仔鸡小肠形态结构的影响

LPS应激会造成肠黏膜损伤,包括组织形态发生改变,如肠绒毛萎缩、隐窝深度增加以及炎性细胞浸润和肠道通透性增加[20-21]。冯焱等[22]研究发现,肉鸡在LPS应激条件下,十二指肠、空肠和回肠VH以及V/C的比值显着降低,CD显着增加。李悦等[23]研究也发现,LPS应激能够损伤肉仔鸡肠黏膜,表现为空肠和回肠的VH以及V/C比值降低,CD加深。本研究结果表明,LPS应激显着降低了21、28 d十二指肠和空肠中VH以及V/C的比值,降低了21 d回肠VH及V/C的比值,且增加了十二指肠CD。本研究结果与上述报道一致,表明LPS应激破坏肠道形态结构,肠道绒毛的生长发育以及机体对营养物质的消化吸收功能也随之受到影响。BS能够促进肠道绒毛发育,增加营养物质与肠道的接触面积,提高动物机体对营养物质的消化吸收能力,还能有效地提高抗感染能力,可有效维护肠道健康[24-26]。本研究发现,在应激条件下,日粮中添加BS显着提高了21 d十二指肠和28 d空肠VH及V/C的比值,表明日粮中添加BS可以改善应激造成的肠道组织结构损伤,促进肠道绒毛的生长发育,维护肠道黏膜的完整性。

3.3 BS对LPS应激肉仔鸡肠道屏障功能的影响

肠道健康是机体健康的前提,是动物机体发挥生产潜能的关键。在畜禽养殖过程中,改善其肠道屏障功能和维持肠道健康是提高生产水平的根本保障。肠道机械屏障主要由肠上皮细胞和连接复合物组成[27-28],是维持肠上皮细胞通透性及其屏障功能的结构基础[29]。肠上皮细胞间的紧密连接由Claudins、Occludin、ZO以及连接黏附分子(JAM)构成[30]。ZO是支撑与维持紧密连接结构的基础,参与连接跨膜蛋白、物质转用以及信号传递的作用;Claudin-1和Occludin是跨膜蛋白家族的主要蛋白,Claudin-1对肠道通透性的稳定起着重要作用,Occludin主要参与维持紧密连接的稳定性[31]。LPS应激能够增加肠黏膜上皮细胞间的通透性,破坏紧密连接蛋白之间的结构和功能,紧密连接蛋白表达降低,肠黏膜屏障受损。LPS作为应激源刺激机体产生应激,机体通过MyD88信号通路激活NF-κB,大量的炎性细胞因子释放于机体,肠道紧密连接蛋白表达下降,进而导致肠道黏膜屏障功能受损[32]。在肉鸡试验上,研究发现,LPS应激能够降低空肠和回肠黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1基因的表达[33-34]。同样的,在仔猪试验上也发现了类似结果,康保聚等[35]研究发现,LPS应激降低了仔猪十二指肠和空肠黏膜ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA的表达丰度,降低了空肠黏膜Occludin、Claudin-1 mRNA 的表达丰度。本试验也发现,LPS应激显着降低了十二指肠、空肠和回肠黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1以及MUC2 mRNA的表达量。本试验结果与前人研究结果一致。日粮中添加BS可显着提高罗斯肉鸡肠道紧密连接蛋白的表达,缓解LPS应激对肠道屏障的破坏。类似的研究也表明,日粮中添加鼠李糖杆菌MLGA可显着提高回肠紧密连接蛋白的表达[34]。本试验中,饲粮中添加BS未能缓解LPS应激引起的肠道紧密连接蛋白表达下调,造成这一差异的原因可能是肉鸡的品种、BS的添加量不同所致,亦或是芽孢杆菌的菌种或菌株功能差异引起[36]。

4 结 论

日粮添加BS可显着降低LPS应激诱导的小肠促炎细胞因子的表达,降低紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量,增加了肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值,有效缓解了免疫应激对肠道形态结构的损伤,促进了小肠的生长发育,维持了肠道的健康。