齐丽娜,陆雪林,杨凯旋,周 瑾,李先玉,刘 珂,张文刚,顾 欣,章伟建*
(1.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103;2.上海市农业科学院,上海 201415)
新浦东鸡是以我国优良地方品种浦东鸡为素材选育而成,由上海市农业科学院畜牧兽医研究所主持育成。新浦东鸡的外貌特征与原浦东鸡相似,属肉用型培育品种,既保留了浦东鸡体大、黄羽、黄脚、肉质好的特点,又克服了浦东鸡早期生长慢、长羽慢等缺点,产蛋性能也有所提高[1]。目前,新浦东鸡的主要养殖区域为上海市农业科学院畜牧试验场(鸡场),该场主要从事新浦东鸡的选种选育工作。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是第三代DNA分子标记技术,在基因组选择育种、亲缘关系分析、种质资源多样性分析等方面得到了广泛的应用[2-6]。目前,已有相当多的学者开展了基于SNP芯片的遗传多样性和遗传结构的研究[7-9]。时坤鹏等[10]基于SNP芯片分析安庆六白猪群体遗传结构时发现,该群体18个公畜样本可划分为5个家系,且该群体内个体间有一定的近交趋势。束婧婷等[11]基于SNP芯片分析瑶鸡2个群体亲缘关系时发现瑶鸡两个群体近交系数很低,亲缘关系较远,遗传多样性较低。李凯航等[12]利用“京芯一号”SNP芯片对300只浦东鸡进行了群体结构分析,并将其划分为38个家系,为浦东鸡的保种和开发利用提供了参考。目前新浦东鸡共有32个家系约1 500只母鸡,但长时间的闭锁繁育可能会引起该群体遗传多样性降低,近交系数增加,最终产生近交衰退现象[13]。
本研究利用“京芯一号”SNP芯片对368只新浦东鸡全基因组范围内的SNPs进行检测,对新浦东鸡群体的遗传结构、亲缘关系和近交系数进行分析,以期揭示个体之间的亲缘关系,为新浦东鸡的选育和开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
本试验所用新浦东鸡来源于上海市农业科学院畜牧试验场(鸡场),在22-23周龄之间,健康状况良好,使用EDTA-K2抗凝采血管采集翅静脉血样本368个,其中公鸡样本110个,母鸡样本258个,与抗凝剂混匀后送至实验室,-20 ℃保存,备用。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取 血液样品利用磁珠法进行基因组DNA的提取,通过0.8%琼脂糖凝胶电泳验证基因组DNA的完整性,使用NanoDrop 2000评估DNA的质量和浓度,OD260 nm/OD280 nm在1.7～2.1且浓度大于50 ng·μL-1的基因组DNA用于SNP芯片分型。
1.2.2 SNP基因芯片分型 对提取合格的基因组DNA(gDNA),利用“京芯一号”基因芯片(北京康普森农业科技有限公司)进行基因分型。首先对gDNA进行片段化、沉淀、杂交缓冲液重悬,然后将重悬的DNA片段加到芯片上,进行杂交孵育,通过清洗去除非特异性结合的DNA,对剩下特异性结合的位点进行单碱基延伸,染色后利用Illumina iScan Reader进行扫描得到idat数据,将原始的idat数据导入Illumina Bead Array Files软件中进行数据分析,最后导出Plink格式文件,生成*.map和*.ped文件用于后续分析。
1.2.3 数据质控 使用Plink(V1.90)软件对芯片数据质控,质控条件为:过滤SNP检出率小于0.9、最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)小于0.01、SNPs检出率小于0.9和哈代-温伯格平衡检验P<10-6的标记,最终有368个个体和42 267个SNPs位点通过质控。
1.2.4 新浦东鸡群体遗传多样性分析 利用Plink(V1.90)软件计算群体的多态标记比例(polymorphic marker ratio,PN)、观察杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,HE)等参数,以此来了解新浦东鸡群体的遗传多样性。
1.2.5 新浦东鸡群体亲缘关系分析 利用Plink(V1.90)软件计算群体个体间的状态同源性(identical by state, IBS)和个体间的遗传距离。使用GCTA(V1.94)软件,分析新浦东鸡的亲缘关系,并通过R软件绘制G矩阵和IBS距离矩阵结果热图。
1.2.6 新浦东鸡群体家系构建 利用Mega X(V10.0)[14]软件的邻接法,并且基于遗传距离分析中得到的遗传距离矩阵来对样本进行聚类。结合基因组亲缘关系分析结果,将现有样本划分为不同的家系。
1.2.7 基于纯合性片段(runs of homozygosity, ROH)的近交程度分析 ROH表示一个个体在染色体上存在连续的基因纯合性,在遗传学研究中具有重要意义,其长度和频率可以反映群体历史[15],通过对ROH的分析可以用来评估个体的近交程度,ROH越长,近交程度越高[16-18]。使用Plink(V1.90)软件计算得到每个样本的ROH长度[19],进而分析得到新浦东鸡群体的近交系数。
2 结 果
2.1 新浦东鸡群体遗传多样性分析
本研究应用“京芯一号”SNP芯片共检测到了55 023个SNPs,通过Plink(V1.90)软件对数据质控,剩余42 267个有效SNPs。本研究中PN为0.78,表明此芯片对于新浦东鸡群体遗传多样性分析适用。经过Plink(V1.90)软件对各位点进行统计,新浦东鸡群体平均有效等位基因数为1.552,多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)为0.237,MAF为0.226;该群体的Ho为0.355,HE为0.353,HE略低于Ho。
2.2 新浦东鸡群体的G矩阵分析
通过构建G矩阵,分析新浦东鸡群体的亲缘关系。图1显示新浦东鸡群体的G矩阵可视化结果。结果表明大部分新浦东鸡个体间的亲缘关系较远,而少部分个体之间存在较近的亲缘关系。
横、纵坐标为个体IDThe horizontal and vertical coordinates indicate the individual ID图1 基因组亲缘关系分析可视化结果图Fig.1 Visual result diagram of genomic phylogenetic analysis
2.3 新浦东鸡群体的IBS距离矩阵分析
IBS距离矩阵结果表明新浦东鸡群体的IBS遗传距离为0.126 8～0.319 5,其平均遗传距离为0.280 9,110只新浦东鸡公鸡IBS遗传距离在0.126 8～0.311 3之间,其平均遗传距离为0.280 1。整个群体的IBS距离矩阵的可视化结果如图2所示,该结果与G矩阵分析结果一致,说明大部分新浦东鸡个体间的亲缘关系较远,而少部分个体之间存在较近的亲缘关系。
横、纵坐标为个体IDThe horizontal and vertical coordinates represent individual ID图2 遗传距离分析可视化结果图Fig.2 Visualization results diagram of genetic distance analysis
2.4 新浦东鸡群体的家系结构分析
公鸡对于整个群体具有重要意义,因此本研究对所有的公鸡样本进行聚类分析,进而判断公鸡样本亲缘关系的远近程度。通过聚类分析(标准为亲缘关系系数大于等于0.1)构建新浦东鸡的公鸡家系,结果如图3所示,110只公鸡最终被划分成32个家系,并根据现有母鸡与公鸡间的亲缘关系,将母鸡划分入不同家系,另外发现有2只母鸡和所有公鸡的亲缘关系系数均小于0.1,未能匹配到相应的家系中,因此将其归入“其他”分类中。
图3 公鸡样本聚类分析结果Fig.3 Results of cluster analysis of male samples
2.5 基于ROH的近交程度分析
ROH在28条常染色体上的分布见图4,结果表明,1号染色体上的ROH数量最多,包含3 886个,而16号染色体上的ROH数量最少,约为41个。
图4 每条染色体上的ROH数量分布Fig.4 Distribution of ROH quantity on each chromosome
个体ROH长度的样本数分布如图5所示,新浦东鸡个体ROH总长度在0～350 Mb之间,ROH长度在100～150 Mb内的个体数比例最大。同时发现个体ROH长度在0～50 Mb、250～300和300～350 Mb之内的个体数很少,只有2个。
图5 个体ROH长度的样本数分布Fig.5 Sample number distribution of individual ROH length
通过对新浦东鸡群体中所有个体ROH长度进行统计,获得基于个体ROH长度的近交系数值。图6显示了基于ROH长度的近交系数可视化结果,并展示全部样本的近交系数分布情况。该群体的平均近交系数值为0.155。
中心的白点代表群体FROH的中位数。小提琴图的宽窄表示群体FROH的概率密度分布The white dot in the middle represents the median FROH of the population. The width of the violin chart represents the probability density distribution of FROH of the population图6 基于ROH的近交系数FROH的分布图Fig.6 Distribution map of the inbreeding coefficient FROH based on ROH
3 讨 论
动物的遗传多样性研究方法目前主要有微卫星标记[20-22]和单核苷酸多态性,但利用微卫星检测多态性费时费力[23],与微卫星相比,SNP芯片分型能够充分反映个体之间的遗传差异,具有准确率高、价格低等优点,是现阶段重要的育种工具之一[24-27]。因此,通过SNP分子标记进行群体遗传多样性和遗传结构分析,对于制定合理育种计划以及进行科学选种选配具有重要意义[28]。
本研究利用SNP芯片从遗传多样性、亲缘关系、家系结构、近交程度等方面评估新浦东鸡群体的结构情况,通过Ne、PN、HE和Ho等参数分析新浦东鸡的遗传多样性。Ne指与实际群体具有相同的基因频率方差或相同杂合度衰减率的理想群体含量[29],由群体的连锁不平衡水平估算得出[30-31],可以作为评估群体遗传多样性和遗传漂变速率的指标。本研究中,新浦东鸡群体的Ne值为40.8,群体Ne值愈大,近交系数增量也愈慢,因此,群体必须保持适当的Ne值,才能使一个品种的优良性状不丢失[32]。本研究中,新浦东鸡群体是由原浦东鸡培育而来的新品种,新浦东鸡的Ne值(40.8)相比于原浦东鸡Ne值(368)大大降低,可能原因是新浦东鸡是以浦东鸡为基础素材,分别与白洛克、红科尼什鸡进行杂交经过多世代选育而成的新品种,其在培育过程中受到了强烈的选择,因此其有效群体含量大大降低。PN指在目标群体中多态性标记位点占总位点的比例。PN值越高,表明多态性位点的比例越高[12]。本研究中,新浦东鸡群体的PN值为0.78,表明该群体中SNP多态性位点的比例较高,遗传多样性较丰富。HE是指在一个群体中,基于群体基因频率和基因型分布推算得出的理论值,预估任意一个个体在某一位点上呈现杂合状态的概率,能够反映群体内基因的多样性程度;HO是某一位点上呈现杂合状态的个体数与总个体数的比例,观测杂合度的值越高,表示群体中呈现杂合状态的个体比例较高,说明群体的基因多样性相对丰富[29]。杂合度高的群体其遗传多样性也就越丰富[33]。本研究中,新浦东鸡群体的Ho为0.355,HE为0.353,Ho略高于HE,表明该群体可能还需进一步纯化[34-35]。
IBS是指两个个体中共有的等位基因序列相同,可以用来评估样本间的相似性[36]。刘彬等[35]的研究认为,由于在实际的育种中,1头种公畜能与多头母畜进行交配,对于种公畜的选择具有比较严格的标准。因此,不同种公畜之间的亲缘关系也相对较远,即整个种群中种公畜的IBS遗传距离会略高于整个群体的平均遗传距离。戴丽荷等[37]也有同样的发现,但本研究发现,新浦东鸡群体的平均IBS遗传距离为0.280 9,公鸡群体的平均IBS遗传距离为0.280 1,公鸡个体间的遗传距离较近,且公鸡的平均IBS遗传距离略低于整个新浦东鸡群体,可能原因是有些个体间存在近交的情况。
本研究中,110只公鸡被划分为32个家系,这32个家系中部分公鸡个体存在亲缘交叉现象,即同一个公鸡可被划分入多个不同家系中。例如P02004既可以划分入家系5也可以划分入家系9,还可以划分入家系10。因此,在后续新浦东鸡家系的纯种繁育过程中,必须要适当调整家系及相应的家系个体组成,以减少近交导致的有害基因增加[12],并且家系4、14、15、21、23、25、27、28、29、30公鸡数量较少,在后续的保种利用工作中应对数量少的家系进行适当扩群,确保家系结构维持平衡。另外在家系构建过程中,有2只母鸡的亲缘关系与任何一个家系的遗传距离都小于0.1未能匹配到相应的家系中,可能与该群体中部分家系在延续的过程中存在缺失有关,因此需要及时定期的对群体的遗传结构情况进行检测,以指导选种选配避免家系缺失情况的发生。
为保持畜禽种群不受外来品种的影响,我国的畜禽群体大多采取相对封闭的运行模式,但是随着时间延长,可能会造成一定程度的近交,造成品种遗传多样性降低,有效群体数量减少[7,38-39]。本研究中,新浦东鸡群体平均近交系数为0.155,近交程度较高。因此,在新浦东鸡的选育过程中,需要适当扩大有效群体含量,并适当调整家系,同时加强饲养管理和系谱记录,避免因系谱记录出错而导致近亲繁殖,防止近交衰退[40]。
4 结 论
本研究基于“京芯一号”SNP芯片对新浦东鸡群体的种群遗传结构和遗传多样性进行了分析,发现新浦东鸡公鸡群体可分为32个家系,具有较高的遗传多样性,但部分个体间亲缘关系较近,近交程度较高,群体内家系多,但部分家系个体数较少,需要制定合理的配种计划,确保家系结构保持平衡,避免造成家系丢失,同时建议在今后的配种选留工作中同一家系的公母鸡避免配种。本研究从基因组水平揭示了新浦东鸡的种群遗传结构和遗传多样性,为后续的选种选配及开发利用工作提供了基础。
