腐殖酸钠对白羽肉鸡营养物质表观消化率、粪便微生物及其代谢产物的影响

李贞明,余 苗,2,唐延天,李袁飞,刘志昌,容 庭,3*,马现永,2*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所 猪禽种业全国重点实验室 农业部华南动物营养与饲料重点实验室 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室 广东省畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心,广州 510640;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,茂名 525000;3.清远市弘顺农牧有限公司,清远 511500)

据《第二次全国污染源普查公报》[1]显示,全国畜禽养殖业水污染排放量中,化学需氧量达到了1 000.53万吨,氨氮11.09万吨,总氮59.63万吨,总磷11.97万吨。针对畜禽污染,我国出台了多项政策并提出了源头减排、过程控制和末端利用的全方位减排理念,其中源头减排主要是通过合理选择饲料原料和在饲料中添加益生菌、天然提取物和酶制剂等的途径来实现[2]。相较于过程控制和末端利用,源头减排成本低,并具有事半功倍的效果,对畜禽养殖污染物的减排具有重要意义[3-4]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

腐殖酸钠中水溶性腐殖酸含量(干物质基础)≥70%。由辉昂化工有限公司提供。

1.2 试验设计

试验选取540只1日龄817白羽肉鸡,随机分为3组(每组6个重复,每个重复30只)。对照组饲喂不含抗生素的基础日粮,试验组分别饲喂含0.3%和0.5%腐殖酸钠的试验饲粮。试验为期42 d。基础日粮选取玉米、豆粕等原料,参照NRC(1994)并结合中华人民共和国农业行业标准《鸡饲养标准》(NY/T33—2004)进行配制,并制成颗粒料。基础日粮组成和营养水平见表1。试验结束前3 d,每个重复选取体重相近的2只肉鸡放入代谢笼,采取全收粪法进行消化代谢试验。

表1 基础日粮组成及营养水平(饲喂基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) %

1.3 饲养管理

试验鸡饲养于广东省农业科学院动物科学研究所试验场,采用地面平养。全期试验鸡自由采食和饮水;1～28日龄,栏舍封闭,室温保持32 ℃,采用全天光照;29～42日龄,栏舍开放,采用自然光照。其他按照常规饲养程序和免疫程序进行饲养和免疫。

1.4 样品采集

试验结束前3 d,每个重复选取体重相近的2只肉鸡放入代谢笼,采取全收粪法进行消化代谢试验。每天10:00收集粪样,并剔除羽毛,随后置于自封袋中,于-20 ℃冰箱保存。连续收集3 d后,取300 g粪样,加入20 mL 10%硫酸,混合均匀。将日粮和粪样65 ℃烘干至恒重,室温回潮24 h后,称重并粉碎。用于测定其中干物质(DM)、能量(GE)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)、磷(P)和粗灰分(Ash)的含量,计算营养物质的表观消化率。另取10 g新鲜粪样保存于-80 ℃冰箱,用于后续微生物及其代谢产物的检测。

1.5 检测指标

1.5.1 营养物质表观消化率的检测 日粮和粪样中营养物质的表观消化率的检测方法如下:分别按照GB/T6435—2006、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018和GB/T 6438—2007测定DM、CP、EE、Ca、P和Ash,采用全自动氧弹热量计Parr 6400(Parr,美国)测定GE。

营养物质表观消化率(%)= 100×[(日粮中营养物质的量-对应粪中该营养物质的量)/日粮中营养物质的量]。

1.5.2 粪便微生物DNA提取和荧光定量PCR检测 称取0.20 g粪样,利用粪便DNA纯化试剂盒(4101050,杭州新景生物试剂开发有限公司)提取、纯化粪便中微生物的总DNA,采用核酸蛋白测定仪(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific)测定DNA的浓度和质量,样品标准吸光度为260/280 在1.80～2.00,260/230 在2.00 左右。采用荧光定量PCR仪(CFX96 Real-time PCR System,Bio-Rad)对粪样中总菌(total bacteria)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、普雷沃氏菌(Prevotella)、梭菌IV(ClostridiumclusterIV)、瘤胃球菌(Ruminococcus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的16S rRNA基因拷贝数进行定量分析,并以10倍梯度稀释的标准质粒作为模板建立标准曲线,标准质粒由广东省农业科学院猪禽种业全国重点实验室提供,计算结果均表示为每克粪样中16S rRNA基因的拷贝数。PCR的反应体系和扩增程序具体参照Yu等[10]的方法,特异性引物由上海生工基因技术有限公司广州分公司合成,PCR引物如表2[11-18]所示。

表2 定量微生物种类以及引物Table 2 Quantitative microbial species and primers

1.5.3 粪便中微生物代谢产物的检测 氨态氮含量的检测:根据Chaney和Marbach[19]的方法,采用比色法测定粪样中氨态氮的含量。

乳酸含量的测定:按照试剂盒说明书步骤测定粪样中乳酸的含量,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

酚和吲哚类物质的检测:参照Yu等[10]的方法处理样品。使用高效液相色谱仪(Waters Alliance e2695,Waters)测定粪样中酚和吲哚类化合物质,并利用外标法通过标准曲线计算其含量。

生物胺含量测定:参照Yu等[10]的方法处理样品。使用高效液相色谱仪(Waters Alliance e2695,Waters)测定粪样中生物胺,并利用外标法通过标准曲线计算其含量。

1.6 数据统计与分析

营养物质表观消化率、微生物和微生物代谢产物的数据结果均以笼为统计单位,采用SPSS 20.0统计软件中单因子方差分析(one-way ANOVA,LSD)方法进行统计分析,使用Duncan氏多重比较检验。所有数据均表示为“平均值±标准误”,P<0.05表示差异显着。

2 结 果

2.1 腐殖酸钠对肉鸡表观消化率的影响

由表3可知,与对照组相比,日粮添加0.5%的腐殖酸钠可显着提高肉鸡对粗蛋白质、磷和灰分的表观消化率(P<0.05)。不同日粮处理对日粮中干物质、总能、粗脂肪和钙的表观消化率无显着影响(P>0.05)。

表3 腐殖酸钠对肉鸡日粮养分表观消化率的影响Table 3 Effect of sodium humate on dietary nutrients apparent digestibility of broilers %

2.2 腐殖酸钠对肉鸡粪便中微生物数量的影响

由表4可知,与对照组和0.3%组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显着提高肉鸡粪便中总菌和乳酸杆菌的数量,并降低大肠杆菌的数量(P<0.05)。与0.3%组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显着提高肉鸡粪便中普雷沃氏菌的数量(P<0.05)。不同日粮处理对肉鸡粪便中厚壁菌门、拟杆菌门、双歧杆菌、梭菌IV和瘤胃球菌无显着影响(P>0.05)。

表4 腐殖酸钠对白羽肉鸡粪便中微生物数量的影响Table 4 Effect of sodium humate on the number of microorganisms in the feces of white-feathered broilers lg(16S基因拷贝数)·g-1

2.3 腐殖酸钠对肉鸡粪便中氨态氮、乳酸、酚和吲哚类化合物含量的影响

由表5可知,与对照组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显着降低肉鸡粪便中氨态氮的含量,并提高乳酸的含量(P<0.05)。与对照组和0.3%组相比,0.5%组肉鸡粪便中的对甲酚显着降低(P<0.05)。不同日粮处理对肉鸡粪便中苯酚、吲哚和粪臭素无显着影响(P>0.05)。

表5 腐殖酸钠对肉鸡粪便中乳酸和含氮化合物含量的影响Table 5 Effect of sodium humate on lactic acid and nitrogenous compounds concentrations in broilers′ manure

2.4 腐殖酸钠对肉鸡粪便中生物胺含量的影响

由表6可知,与对照组和0.3%组相比,日粮添加0.5%腐殖酸钠可显着降低肉鸡粪便中酪胺、亚精胺、精胺和总生物胺的含量(P<0.05)。与对照组相比,日粮添加0.3%和0.5%腐殖酸钠可显着降低肉鸡粪便中腐胺的含量(P<0.05);另外,日粮添加0.3%腐殖酸钠可显着降低肉鸡粪便中酪胺和精胺的含量(P<0.05)。不同日粮处理对肉鸡粪便中甲胺、色胺和尸胺的含量无显着影响(P>0.05)。

表6 腐殖酸钠对肉鸡粪便中生物胺含量的影响Table 6 Effect of sodium humate on biogenic amine concentrations in broilers′ manure μg·g-1

3 讨 论

3.1 腐殖酸钠对肉鸡营养物质表观消化率的影响

表观消化率是反映试验动物对日粮中营养物质消化吸收水平的重要指标。在本试验中,日粮添加0.5%的腐殖酸钠可显着提高粗蛋白、磷和灰分的表观消化率。Wang等[20]研究发现,日粮添加腐殖酸钠可显着提高肉鸡对有机物和干物质的表观消化率。Wang等[21]研究则表明,羔羊对日粮养分的表观消化率不受腐殖酸的影响。本试验结果与上述的结果并不一致,可能是添加剂量和生产厂家的不同所导致的,具体原因还需进一步研究。腐殖酸钠是一种有机弱酸盐,可调节并稳定畜禽消化系统中的pH,提高消化酶的活性,促进畜禽肠道对营养物质的消化与吸收[22-24]。同时,腐殖酸钠作为一种螯合剂,具有较强的络合力、离子交换作用和吸附作用,在日粮经过畜禽肠道时,腐殖酸钠通过吸附作用使日粮中的营养物质缓慢通过肠道,延长营养物质的消化吸收时间,提高营养物质的表观消化率[25-26]。因此,腐殖酸钠提高肉鸡对营养物质的表观消化率,可能是因为腐殖酸钠提高了肉鸡肠道中有益菌的数量,稳定了肠道环境的pH,刺激消化酶分泌,并通过吸附作用,延长营养物质的消化吸收时间,进而提高肉鸡对营养物质的表观消化率。

3.2 腐殖酸钠对肉鸡粪便中微生物数量的影响

肠道菌群与畜禽机体代谢和健康水平密切相关,是维持肠道屏障功能和稳定肠道微生态环境的关键[27]。乳酸杆菌和普雷沃氏菌是肉鸡肠道中的有益菌,乳酸杆菌作为优势菌群定植在肉鸡肠道中,具有产生挥发性脂肪酸和抑菌因子的功效,可有效改善肠道环境,抑制有害菌的生长和繁殖;普雷沃氏菌是短链脂肪酸的主要生产菌,可通过促进肠道黏膜的发育来稳定肠道环境[28-29]。大肠杆菌属于畜禽肠道中常见的病原菌,产生内毒素和肠毒素破坏肠道黏膜屏障,导致畜禽肠道感染,影响畜禽机体健康[30]。在本试验中,日粮添加0.5%的腐殖酸钠可显着提高肉鸡粪便中乳酸杆菌的数量,并降低大肠杆菌的数量。这与Domínguez-Negrete等[31]研究一致。腐殖酸钠是一种多功能化合物,富含生物碱、维生素和生物活性物质,具有抗菌、抗炎和止泻等功能[32]。腐殖酸钠能够调控肠道菌群,可能是因为腐殖酸钠富含多种功能性活性物质,促进有益菌的生长繁殖,使有益菌分泌乳酸、短链脂肪酸和抑菌因子等,抑制大肠杆菌等有害菌的生长繁殖。这也进一步验证了腐殖酸钠可通过改善肠道微生态环境,提高肉鸡对营养物质的表观消化率。

3.3 腐殖酸钠对肉鸡粪便中乳酸和含氮化合物含量的影响

日粮中未被胃和小肠消化吸收的含氮物质进入后肠后会被微生物发酵生成氨态氮、酚和吲哚类化合物等臭味物质,其中高浓度氨态氮抑制肠道上皮细胞的增殖与分化,降低线粒体的氧化作用,增加腹泻率;高浓度对甲酚具有遗传毒性和致癌性,不利于肠道健康[33-34]。McMurphy等[35]和Ikyume等[36]研究表明,腐殖酸具有较强的氮结合能力,可显着降低肉牛和山羊瘤胃中氨态氮的浓度。本试验中,肉鸡粪便中氨态氮和对甲酚的浓度显着降低,可能与腐殖酸钠的氮结合能力有关。此外,日粮添加0.5%的腐殖酸钠显着提高了肉鸡粪便中乳酸的含量,这与腐殖酸钠提高粪便中乳酸菌的数量有关。研究表明,乳酸可有效抑制致病菌的生长与繁殖,并降低其发酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,减少畜禽粪便中的臭味物质的产生[37-38]。因此,腐殖酸钠降低肉鸡粪便中的含氮化合物的浓度,一方面是因为腐殖酸钠具有较强的氮结合能力,另一方面是因为腐殖酸钠抑制有害菌的生长与繁殖,降低发酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,进而减少臭味物质的产生。

3.4 腐殖酸钠对肉鸡粪便中生物胺含量的影响

生物胺主要是微生物对氨基酸进行脱羧产生的一种有机碱性化合物,包括一元胺、二元胺和多胺[39-40]。例如,酪氨酸脱羧生成酪胺;精氨酸脱羧生成腐胺、亚精胺和精胺。高浓度酪胺、腐胺、亚精胺和精胺具有毒性,能引起高血糖、偏头痛、肾衰竭和肿瘤在内的相关疾病[41]。何俊娜等[42]报道称,腐殖酸可影响微生物对含氮化合物的代谢水平。本试验结果显示,日粮添加腐殖酸钠可显着降低肉鸡粪便中酪胺、腐胺、亚精胺、精胺和总生物胺的浓度,表明腐殖酸钠可抑制微生物对酪氨酸和精氨酸的脱羧反应,降低相关生物胺浓度。余苗等[34]研究表明,大肠杆菌等微生物具有代谢含氮化合物产生生物胺的能力。在本试验中,日粮添加腐殖酸钠显着降低了肉鸡粪便中大肠杆菌的数量,进一步验证了腐殖酸钠具有降低肉鸡粪便中生物胺浓度的作用。

4 结 论

日粮添加腐殖酸钠可提高肉鸡对日粮中粗蛋白、磷和灰分的表观消化率,促进粪便中乳酸菌的生长与繁殖,提高乳酸的浓度,抑制大肠杆菌的生长与繁殖;同时,降低粪便中氨态氮、对甲酚、腐胺、酪胺、亚精胺、精胺和总生物胺等臭味物质的浓度,达到源头减排的目的,且在本试验条件下添加0.5%的效果优于0.3%。