姚 颖,周应聪,杜培岩,李一娟,钱文洁,李柳杨,余志鹏,崔 燕, 余四九,2,樊江峰,2*
(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州 730070)
牦牛(Bosgrunniens)是生活在青藏高原上的重要家畜资源,与普通牛相比,牦牛性成熟较晚,通常在3～4岁。牦牛繁殖力较低,平均繁殖率仅为48.61%,半数以上的牦牛两年一胎或三年两胎[1-2]。由于恶劣的生存环境和高发的衣原体病,导致牦牛自然流产率较高。2014年胡广卫等[3]的调查资料表明,在青海省玉树县、海晏县等地区牦牛流产率高达30%以上。较低的繁殖率和较高的流产率是影响牦牛生产效益的重要因素。妊娠是一个极其复杂的过程,要经历受精卵形成、卵裂、胚泡附植、胚胎和胎盘的发育及妊娠维持等一系列连续的生物学过程[4],大量分子、细胞及信号通路参与到了妊娠过程的调节。妊娠期间,为了满足胎儿生长发育的需求,母体多个组织器官的新陈代谢活动都发生了显着的改变,血液中蛋白种类和浓度也发生了相应的变化[5]。同样,妊娠阶段所发生的分子事件也会受到蛋白种类和表达水平的调节。因此,血液蛋白质组分析是在分子水平上探究妊娠调控机制的重要手段。
串联质谱标签技术(tandem mass tag, TMT)是通过多个稳定同位素标记,特异性标记多肽的氨基酸基团进行串联质谱分析,可用于研究不同组织样品中蛋白质表达水平的差异[6]。相比于其他定量蛋白质组学技术,TMT技术在通量和同位素标记数量上更具有优势,并且其灵敏度和可重复性较高。蛋白质组学技术的发展及其在动物体中的研究应用,为动物复杂的繁殖生理调控机制的研究提供了新的方法和思路,但目前关于妊娠阶段牦牛血液蛋白质表达变化的研究鲜有报道。本研究采用TMT技术检测不同妊娠阶段血清蛋白的表达差异情况,分析差异表达蛋白参与的信号通路和生物学过程,将为进一步探明牦牛妊娠维持的分子机制,开发新的流产防治药物和技术策略提供一些基础资料。
1 材料与方法
1.1 血液样品的采集与分组
在甘南藏族自治州夏河县牙利吉乡阿纳扎西牦牛养殖合作社内选择9头4岁半至6岁龄,健康状况良好且当年未产犊的自然发情牦牛进行人工授精(artificial insemination, AI),并分别在AI后第30、60及90天,采用颈静脉采血法采集其饲喂前的血液样品5 mL·头-1,室温3 500 r·min-1离心10 min,获取上清液收集在1.5 mL的灭菌离心管中,编号,并置于-80 ℃冰箱保存备用。授配母牦牛在AI后第70和90天利用直肠触诊检查结合B超探查进行妊娠诊断,并依据诊断结果对采集样品进行回顾性分组,即妊娠第1月组(FP)、妊娠第2月组(SP)及妊娠第3月组(TP)。未妊娠组(NP)血样采自AI后90天并经妊娠诊断确诊为未孕的牦牛个体。每组样品3个生物学重复,用于蛋白质组学检测。
1.2 血清蛋白的提取和定量
取200 μL血清样品置于培养皿中,用PBS洗涤两次,离心取沉淀后加入1 mL的预冷SDS裂解缓冲液(含10 μL蛋白酶抑制剂、10 μL PMSF),4 ℃玻璃匀浆器上下手动匀浆20次。取匀浆液转移到1.5 mL预冷的离心管中,冰上放置10 min,4 ℃、16 000 r·min-1离心10 min,取上清液,即为血清总蛋白。使用ProteoMinerTM蛋白富集试剂盒(Bio-Rad)去除血清总蛋白中高丰度的蛋白质,然后使用BCA试剂盒对去除高丰度蛋白的血清蛋白样品进行蛋白质定量检测。
1.3 蛋白酶解与TMT标记
取200 μg蛋白溶液于离心管中,使用1.5 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键,37 ℃反应1 h,冷却至室温后加入30 mmol·L-1碘乙酰胺(IAA)避光反应30 min,然后移入超滤管中离心弃去收集液。在超滤管中用赖氨酸蛋白酶(Lys-C)按照酶和蛋白1∶200的比例预消化蛋白质3 h,然后在37 ℃下用胰蛋白酶(Trypsin)按照酶和蛋白1∶100的比例过夜消化。消化后的多肽溶解在适当体积的100 mmol·L-1HEPES(pH 8.0)中,按照TMT试剂盒说明书,使用12-plex TMT试剂进行标记。
1.4 高pH反相分级
将TMT标记的多肽脱盐干燥后,采用碱性高pH反相高压液相色谱法进行肽分级。TMT标记的混合多肽在溶液A(5 mmol·L-1NH4OH, 20% ACN, pH=10.0)中溶解,经C18色谱柱分级。分离梯度如表1所示。从5 min 到80 min每1 min收集洗脱物至1.5 mL离心管中,将收集的约60个组分的洗脱物合并为12个组分,真空干燥。
表1 高pH分离梯度表Table 1 High pH separation gradient table
1.5 LC-MS/MS 质谱分析
将样品溶于液相A液(100% H2O, 0.1% FA)中采用Nano LC系统进行洗脱分离,选择250 μL·min-1流速,并使用2%～100%液相B液(80% ACN, 0.1% FA)的线性梯度洗脱60 min分离样品。分离后的样品进行质谱定量分析,MS条件设置如下,OTMS1分辨率60 000,自动增益控制目标(AGC)为1e6,最大离子注入时间(Max IT)为50 ms;OTMS2分辨率30 000,AGC为5e4,Max IT为200 ms,动态排除参数为6 s。
1.6 数据库与数据分析
质谱下机原始数据为RAW文件,借助Proteome Discovery 1.4软件对数据库GCF_000298355.1_BosGru_v2.0_protein.faa (28 881条蛋白序列)进行搜索。具体搜库参数如表2所示。
1.7 生物信息学分析
以差异倍数(fold change, FC)≥1.2或≤0.83,且P<0.05为条件对所获得的蛋白质筛选差异表达蛋白。并对所得的DEPs使用BLASTALL(v2.2.26, evalue设置为1e5)软件进行GO、KEGG数据库注释,分析其生物学功能。利用STRING在线分析软件(https://string-db.org)对差异蛋白进行蛋白网络互作分析。
表2 Proteome Discovery搜库参数Table 2 Proteome Discovery search parameters
2 结 果
2.1 蛋白定量
不同组别的12份血清样本(FP: 1-3, SP: 1-3, TP: 1-3, NP: 1-3)去除高丰度蛋白前后的定量结果如表3所示。结果显示,本试验血清样本总蛋白的提取及高丰度蛋白的去除成功,可以满足后续TMT蛋白质组学的试验要求。
表3 高丰度蛋白去除前后血清蛋白定量结果Table 3 Quantitative results of serum protein before and after high-abundance protein removal
2.2 蛋白质鉴定
样品经过TMT标记及LC-MS/MS鉴定分析后,以错误发现率(false discovery rate, FDR) ≤0.01的条件进行过滤,共获得3 933个肽段,共鉴定出497个蛋白质。鉴定到的肽段长度分布如图1所示,所测肽段分布长度主要集中在6～25个氨基酸之间,说明肽段酶解较为充分。将所鉴定的蛋白质的分子量分布进行统计,结果如图2所示,分子量>100 ku的蛋白最多,其次是分子量在20～30 ku和50～60 ku的蛋白,分子量<10 ku的最少,且主要集中分布在10～60 ku。
图1 肽段长度分布图Fig.1 Peptide length distribution chart
2.3 差异表达蛋白的筛选
以差异倍数FC≥1.2或≤0.83,且P<0.05为条件进行筛选,共得到处于妊娠期不同阶段及未妊娠期中的牦牛血清差异表达蛋白68个,对各组间差异表达蛋白的分布绘制火山图,如图3所示。由图可知,FP与SP组共有4个DEPs,其中上调4个,下调0个;FP与TP组共有34个DEPs,其中上调17个,下调17个;SP与TP组共有44个DEPs,其中上调17个,下调27个;TP与NP组共有18个DEPs,其中上调10个,下调8个。各组间的部分DEPs信息如表4、5、6、7所示。
图2 蛋白分子量分布图Fig.2 Protein molecular weight distribution chart
A、 B、C、D分别表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP组差异蛋白火山图 A, B, C, and D represent the differential protein volcano maps of FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, and TP vs. NP groups, respectively图3 牦牛血清差异蛋白火山图Fig.3 Volcano plot of differential proteins in yak serum
表4 FP vs. SP组牦牛血清差异蛋白信息Table 4 The serum differential proteins information of yak in FP vs. SP group
表5 FP vs. TP组部分牦牛血清差异蛋白信息Table 5 The serum differential proteins information of yak in FP vs. TP group
表6 SP vs. TP组部分牦牛血清差异蛋白信息Table 6 The serum differential proteins information of yak in SP vs. TP group
2.4 DEPs的GO富集分析
利用BLAST软件对GO数据库进行搜索,将FPvs.SP、FPvs.TP、SPvs.TP、TPvs.NP四组对照组中的差异蛋白进行功能注释,并对各组差异表达蛋白和全部蛋白背景下GO各二级功能条目的蛋白富集情况进行分析,如图4所示。结果表明,各组差异蛋白的GO功能富集情况基本相似,在生物学过程中主要富集在生物调节、代谢、免疫系统、粘附及发育等过程;在细胞组分中主要富集在细胞外区域、细胞器、蛋白复合体和膜封闭腔等;在分子功能中主要富集在结合、催化活性、分子功能调节、抗氧化活性和转运活性等方面。
表7 TP vs. NP部分牦牛血清差异蛋白信息Table 7 The serum differential proteins information of yak in TP vs. NP group
2.5 DEPs的KEGG富集分析
将各组间的KEGG富集分析结果以散点图的形式可视化,如图5所示。结果表明,差异表达蛋白在37个通路中被富集,图中呈现了显着性Q值最小的前20个通路,且富集因子越大,表示差异表达蛋白在该通路中的富集水平越显着。结果发现,FPvs.TP、SPvs.TP和TPvs.NP组的差异蛋白主要富集于补体与凝血级联、细胞粘附分子和金黄色葡萄球菌感染等与炎症和免疫防御相关的途径中,FPvs.SP组主要富集在造血细胞谱系通路中。并且在妊娠期(FP、SP、TP)的各组间差异蛋白富集通路中均包含有PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信号通路。
(图4续 Continued)
(图4续 Continued)
A、 B、C、D分别表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP组差异蛋白GO富集分析 A, B, C, and D represent GO enrichment analysis of differential proteins in FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, TP vs. NP groups, respectively图4 牦牛血清差异表达蛋白GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in yak serum
(图5续 Continued)
(图5续 Continued)
A、B、C、D分别表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP组差异蛋白KEGG通路富集分析 A, B, C, and D represent the KEGG pathway enrichment analysis of differential proteins in FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, and TP vs. NP groups, respectively图5 牦牛血清差异表达蛋白KEGG通路富集散点图Fig.5 Scatter plot of KEGG pathway enrichment of differentially expressed proteins in yak serum
2.6 与妊娠维持潜在相关DEPs的筛选
对妊娠期和未妊娠期的差异蛋白进行综合分析,发现有5种蛋白:胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)、纤维蛋白原γ(FGG)、β-2微球蛋白(B2M)、蛋白二硫化物异构酶A4(PDIA4)、锌-α-2-糖蛋白1(AZGP1),如表8所示,它们在妊娠期(FP、SP和TP)具有连续的表达差异趋势,即在妊娠第3月(TP)表达量最高,妊娠第1、2月(FP和SP)表达量降低,并且这些蛋白在妊娠第3月(TP)相对于未妊娠(NP)状态下调,说明这些蛋白在妊娠第3月(TP)状态下表达量显着高于未妊娠状态。因此这些蛋白可能参与妊娠维持过程,并发挥一定的生物学作用。
表8 重要DEPs筛选信息Table 8 The screening information for important DEPs
2.7 与妊娠维持潜在相关DEPs的网络互作分析
利用STRING在线软件(https://string-db.org)对所筛选的可能与妊娠维持相关的差异蛋白绘制网络互作(PPI)分析图,结果如图6所示。图中节点代表蛋白质,部分节点内有螺旋结构,表示该蛋白结构已知。部分节点内是空的,则表示该蛋白结构暂时未知。节点之间的连线表示蛋白之间的相互作用,连线越多表示蛋白间的相互作用关系越强。在PPI网络图中显示,筛选出的差异蛋白多数存在互作关系,说明我们所鉴定筛选出的蛋白质在牦牛妊娠期相互作用,进而在维持妊娠中共同发挥作用。
图6 与妊娠维持潜在相关DEPs的网络互作分析Fig.6 Network interaction analysis of DEPs potentially related to pregnancy maintenance
3 讨 论
哺乳动物妊娠过程的建立和维持涉及到母体多器官和系统细胞生物学、生物化学等多方面的适应性调节。蛋白质是基因表达翻译的最终产物,蛋白质组学可以对某一时期机体处于特定生理状态下的所有蛋白质进行组学鉴定和研究,通过蛋白丰度的变化来揭示机体相关生物学过程和功能转变的分子机制。本研究采用TMT联合LC-MS/MS技术对处于妊娠第1、2、3月及未妊娠的牦牛血清样品进行了蛋白质组学分析,结果共检测到3 933个肽段,定量出497个蛋白质,筛选出68个DEPs。
通过各组间差异表达蛋白的GO功能注释,发现DEPs主要富集在生物过程中的代谢、免疫、粘附和生物调节,细胞组分中的细胞外区域、细胞器以及分子功能中的结合和催化活性。研究表明,妊娠会引起母体代谢的实质性改变,妊娠的前3个月是合成代谢的状态,这一阶段母体血液内孕激素、雌激素和糖皮质激素等类固醇激素含量升高有利于脂质沉积[7-8]。妊娠早期的合成代谢阶段至关重要,因为胎儿的能量需求无法仅通过增加能量摄入来满足,更依赖于妊娠早期积累的脂肪储存[9]。并且有研究表明,妊娠期间类固醇激素与滋养细胞的增殖以及妊娠的健康发展密切相关[10],由此说明类固醇代谢与妊娠维持相关,对支持胎儿的生长和发育具有关键作用。研究表明,细胞粘附涉及胚胎细胞外基质的构建和胚胎与子宫内膜的附着等生殖过程,并影响滋养细胞的增殖和分化[11],因此细胞粘附过程对妊娠维持有重要意义。妊娠是一个动态的免疫过程,胚胎所携带的遗传物质一半来自母体,另一半来自父体,当胚胎进入母体内并且在子宫内膜上种植时无异于异体植入,会刺激母体免疫系统。免疫系统通过激活补体C途径和诱导内肽酶对异物做出反应,使得母体处于炎症增加的状态[12-13]。同时为了保证胎儿不被母体免疫排斥,许多免疫相关分子会在母胎界面建立免疫耐受,并允许异基因胎儿在滋养层侵入母体组织,进而允许胎儿和胎盘的发育[14-15],因此妊娠期母体免疫调节的动态平衡对于妊娠的建立和维持是至关重要的。
KEGG富集分析表明,妊娠期各组间的差异蛋白主要富集在补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染等与炎症和免疫防御相关的通路以及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信号通路中。妊娠维持、胎盘和胎儿发育以细胞增殖、迁移、分化、转化和凋亡等细胞过程为特征[16],且这些细胞过程依赖于信号通路的活动。Rap1信号通路涉及多种细胞过程,包括细胞间的相互作用、细胞分子的粘附和增殖以及胎儿发育过程中细胞极性的调节[17]。此外,Rap1信号通路还参与维持上皮和内皮细胞连接的完整性,从而维持胎儿的生存能力[18],因此推测Rap 1通路可能通过调节胎盘和胎儿发育进而维持妊娠的健康发展。MAPK信号通路参与细胞增殖、分化和转化过程,同时它还参与了胎盘发育期间胚胎和卵黄囊的血管生成[19]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径经常在各种细胞中被激活,并促进多种细胞增殖、粘附、迁移、侵袭和血管生成[20-21]。因此推测,MAPK和PI3K-Akt通路可能与妊娠过程中滋养细胞的增殖和胎盘发育中的血管生成有关。金黄色葡萄球菌感染通路是一种与炎症相关的通路,在人类和动物中的研究表明,妊娠中胎盘涉及滋养细胞侵润和血管生成过程,它的成功依赖于一定程度的子宫炎症[22-23],因此低程度的炎症有益于正常胎盘的生长发育。补体系统在先天免疫和适应性免疫过程中起关键作用,其经典通路可以被凋亡细胞激活,正常孕妇的滋养细胞凋亡伴随着缺血和氧化应激的增加,进而导致滋养细胞碎片脱落进入母体循环[24],这也解释了为什么在牦牛正常妊娠中大量分子富集在补体及凝血级联途径中。本研究提示,DEPs可能通过细胞粘附、免疫调节和代谢等生物过程以及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信号通路,参与调节胎儿组织细胞的增殖和胎盘的生长发育过程,进而在牦牛妊娠维持中发挥关键作用,并且当这些生物过程和通路失调时可能会损害胎盘和胎儿的生长发育,甚至导致妊娠失败。
通过比较发现,IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4和AZGP1 在牦牛妊娠期血清中具有连续上调的表达趋势,并且这些蛋白在妊娠第3月表达量显着高于未妊娠状态。因此推测,这些蛋白在牦牛妊娠维持过程中发挥着重要的生物学作用。IGFBP2是一种发育调控因子,具有促进细胞分化、刺激有丝分裂和防止凋亡等功能,能够与IGF-2相互结合并调节IGF-2对胚胎生长功能的促进作用[25]。高飞[26]研究发现,在人类中IGFBP2表达减少会抑制胎盘滋养细胞的侵袭及增殖,导致子宫肌层螺旋小动脉重铸障碍,进而诱发早产甚至流产。本研究中,IGFBP2在妊娠期表达上调,意味着其可能通过调控胎盘滋养细胞的侵袭和增殖,参与胎盘植入和发育过程,进而维持妊娠。FGG是纤维蛋白原三条肽链(α、β和γ)中的一条,作为纤维蛋白原的结构域发挥功能[27]。正常妊娠时,母体血液中促凝活性显着增高,凝血效率增加,纤维蛋白原和凝血因子升高,母体纤维蛋白原通过维持止血平衡和稳定胎儿-母体接合处的纤维蛋白层的子宫胎盘附着来支持妊娠[28]。Iwaki等[29]研究发现,敲除FGG基因的小鼠因为子宫内大量异常出血使得胎盘和卵黄囊严重受损破裂,导致胎儿死亡,妊娠不能维持至足月。因此,FGG可能通过维持胎盘止血平衡进而在维持牦牛妊娠中发挥重要作用。B2M属于I类主要组织相容性复合体(MHC)的组成部分,参与抗原的加工与呈递,在促进免疫细胞的抗原呈递和母体-胎儿界面的血管生成方面发挥重要作用[30]。在妊娠期间,充分的抗原呈递可以促进免疫应答进而诱导滋养层侵袭、组织重塑、胚胎发育和胎盘形成[31]。研究表明,人血清中B2M的含量随着妊娠周期的增加而增加[32],这与本试验中鉴定出的血清B2M的变化趋势相一致。PDIA4是蛋白质二硫键异构酶家族(PDIs)中的一种内质网蛋白,在维持氧化还原稳态和内质网蛋白质折叠等生物学过程中发挥重要作用[33]。正常妊娠中,随着胎龄的增加,胎盘滋养层细胞会产生一定程度的内质网应激反应,轻度的应激反应会导致机体产生抗氧化防御等一系列适应性反应[34]。因此推测,PDIA4作为内质网蛋白,可能通过调节胎盘内质网应激,诱导机体产生抗氧化防御,进而起到维持妊娠的作用。AZGP1是一种新型脂质动员因子,具有抗原的加工和呈递功能,参与细胞粘附、免疫系统调节、炎症反应和脂质代谢[35-36]。研究发现,在小鼠体内AZGP1可以促进脂联素表达升高,而脂联素又被发现可以降低小鼠自然流产的风险,对维持正常妊娠有积极作用[37-38]。由此提示,AZGP1可能通过影响脂联素的表达直接或间接调节脂质代谢,从而参与牦牛的妊娠维持。
4 结 论
本研究利用TMT技术对不同妊娠阶段和未妊娠的牦牛血清进行分析,结果表明牦牛妊娠早期存在着明显的血清蛋白组的变化。通过对这些DEPs进行筛选与功能分析,发现它们分别富集在代谢、免疫、粘附及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等与生殖相关的条目与通路中。这些DEPs在促进细胞粘附与增殖、促进母胎血管生成、维持母体代谢与免疫平衡等过程中起到重要作用,进而维持母体在妊娠期各器官和系统的动态平衡。其中IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1的表达在妊娠早期具有连续上调的趋势,推测其可能通过调节胎盘生长发育、免疫应答和脂质代谢,参与了牦牛的妊娠维持过程。本研究是利用蛋白质组学探索在不同妊娠阶段和未妊娠牦牛的差异蛋白的初步试验,这些结果为进一步探明牦牛维持妊娠过程的调控机制提供了基础资料。
