王 莹,李佳康,曾 悦,史开拓,韦丽婷,彭佳佳,李秋燕,曹龙龙*,周登元,*
(1.武汉科前生物股份有限公司,武汉 430000;2.华中农业大学动物科学技术学院动物医学院,武汉 430070)
猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae)水疱性病毒属(Vesivirus),可感染所有猫科动物,目前无特效治疗药物[1]。FCV感染后主要表现为口炎、结膜炎、鼻炎等炎症和全身性的发热等,有时也可引起胃肠炎症,偶尔出现皮肤溃烂、肺炎、跛行等[2]。刘健等[3]对上海市17例呼吸道症状的猫病例进行FCV的鉴定,阳性率达到76.47%。由于FCV感染后极难清除,康复后仍然会长期带毒并存在持续排毒的情况,这导致FCV仍是目前猫科动物重要的传染病之一,防控形势严峻[4]。
FCV基因组全长约7.7 kb,单股正链RNA(ssRNA)病毒,无囊膜,直径为35～40 nm,核衣壳为二十面体对称结构[5]。目前,FCV只有一种血清型,根据遗传进化关系分为2种基因型(基因Ⅰ型和Ⅱ型),但没有明显的地域分布,而不同毒株间存在较明显的抗原差异性[1]。随着经济的不断发展,我国宠物猫数量逐年增加,临床急需特效治疗的生物制剂以及快速鉴定FCV感染的方法来缓解我国FCV的防控及治疗压力。近年来,单克隆抗体技术已被广泛应用于ELISA、胶体金等方向。相关研究表明,无论是以FCV全病毒还是FCV VP1衣壳蛋白作为免疫原,均可得到良好的单克隆抗体[5]。本研究基于国内FCV流行毒株,通过蔗糖梯度离心制备FCV免疫原进行单克隆抗体制备,为FCV的诊断方法优化、流行毒株筛选以及深入研究提供生物原料。
1 材料与方法
1.1 主要材料
FCV-SH192(GenBank: OM650792.1)、FCV-HB29(GenBank: OM650783.1)、FCV-JS143(GenBank: OM650785.1)、FCV-HN183(GenBank: OM650786.1)和FCV-SD348(GenBank: OM650796.1)均由本实验室分离、鉴定和保存;FCV阳性血清和阴性血清均由本实验室提供。
1.2 FCV蔗糖梯度离心纯化及免疫原制备
将FCV-SH192病毒按照参考文献[5]中蔗糖梯度离心纯化方法进行纯化,纯化后灭活作为免疫原。
1.3 FCV单克隆抗体的制备
参照文献[6]中单克隆抗体的制备方法,将纯化灭活后的FCV-SH192株作为免疫原进行小鼠免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选和腹水制备。
1.4 单克隆抗体的生物学特性鉴定
参照文献[7]中单克隆抗体的鉴定方法进行杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定、单克隆抗体类型鉴定、间接免疫荧光(IFA)特异性鉴定和蛋白免疫印迹(Western blot)特异性鉴定。
1.5 单克隆抗体腹水的ELISA效价检测
按照常规间接ELISA方法对所制备的单克隆抗体腹水进行效价检测[7]。
1.6 单克隆抗体腹水与不同毒株反应性
取单克隆抗体腹水(1∶500稀释),采用IFA和Western blot测定其与5株FCV毒株(FCV-SH192、FCV-HB29、FCV-JS143、FCV-HN183和FCV-SD348)的特异反应性。
2 结 果
2.1 FCV单克隆抗体的制备、效价测定与抗体类型鉴定
经4次亚克隆,获得1株分泌FCV抗体的杂交瘤细胞,命名为3B11。将其连续传代至40代,每5代上清抗体效价检测基本稳定。抗体类型鉴定显示,3B11单抗重链为IgG1亚类,轻链为κ链。
2.2 单克隆抗体的特异性鉴定
IFA结果显示:MAb 3B11可与FCV-SH192株产生特异性荧光,荧光强度与阳性对照一致(图1A)。Western blot结果显示:MAb 3B11可与FCV-SH192株发生特异性反应,条带与阳性对照一致,与F81细胞无反应(图1B)。
A. IFA鉴定MAb 3B11的特异性;B. Western blot鉴定MAb 3B11特异性。M. 蛋白质相对分子质量标准 A. IFA identified the specificity of MAb 3B11;B. Western blot identified the specificity of MAb 3B11. M. Protein marker图1 单克隆抗体3B11的特异性鉴定Fig.1 Specificity identification of monoclonal antibody 3B11
2.3 单克隆抗体腹水的ELISA效价检测
3B11杂交瘤细胞所制备腹水对5株FCV毒株ELISA效价为1∶12 800～1∶51 200(图2)。
图2 单克隆抗体腹水3B11对5株FCV毒株的ELISA效价检测Fig.2 ELISA assay of monoclonal antibody ascites 3B11 against 5 FCV strains
2.4 单克隆抗体腹水与不同毒株反应性
腹水MAb 3B11与5株FCV均可产生IFA特异性荧光,其中FCV-HB29荧光稍弱,其余荧光强度与阳性对照一致(图3A);腹水MAb 3B11与5株FCV均可发生Western blot特异性反应,且条带大小一致,与F81细胞无反应(图3B)。
3 讨 论
A. 不同FCV毒株的IFA反应性;B. 不同FCV毒株的Western blot反应性。M. 蛋白质相对分子质量标准 A. IFA reactivity of different FCV strains;B. Western blot identification results of different FCV strains. M. Protein marker图3 单克隆抗体腹水3B11与不同FCV毒株的IFA和Western blot反应性Fig.3 IFA and Western blot reactivity of monoclonal antibody ascites 3B11 with different FCV strains
FCV的高变异性使得其疫苗有效性较差。据刘健等[3]报道,上海分离株与FCV-F9疫苗株遗传关系较远,他们认为这是当前疫苗对猫的免疫效果不佳的主要原因。因此“早发现、早诊断、早治疗”是FCV防控的主要措施之一[8]。目前临床上快速诊断FCV感染以qRT-PCR为主[9],近年来ERA、NanoPCR等方法也研究、开发出来,但存在较大的局限性——需特殊专业仪器及场地[10-11]。目前,针对猫泛白细胞减少症病毒的单克隆抗体的临床应用已相对成熟,而FCV的相关研究却相对薄弱[9-11]。因此本研究为了优化当前诊断方法,将FCV灭活后作为免疫原进行单克隆抗体制备,成功筛选到的1株FCV单克隆抗体。研究表明该抗体具有良好的特异性,并对5株国内流行FCV毒株均具有IFA、Western blot结合特性。这与先前所报道的FCV虽然变异较大但单一毒株作为免疫原筛选的抗体对不同毒株之间仍具有一定结合特性的相关研究结果相符[6]。目前FCV基因的多样性是抗原检测和疫苗免疫失败的主要原因,但本研究的抗体对多株流行且遗传关系较远的毒株具有广泛的结合特性,因此可为国内FCV流行毒株分离、鉴定、筛选以及诊断方法的优化提供生物原料。
4 结 论
本研究成功制备的MAb 3B11对FCV具有良好的特异性、免疫反应性及广谱识别性,可作为FCV免疫学诊断的工具,为FCV的诊断方法优化、流行毒株筛选以及深入研究提供生物原料。
