过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成的影响

左子珍,王海波*,柴志欣,符健慧,张翔飞,罗晓林,钟金城*

(1.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,成都 610225;2.四川省青藏高原草食家畜工程技术中心,成都 610225;3.四川省草原科学研究院,成都 611731)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及周边地区特有的“全能型”家畜,为牧民提供赖以生存的肉、奶等畜产品,也是牧民在高原上的主要交通和驮运工具,素有“高原之舟”的美誉[1]。全世界大约有1 700多万头牦牛,其中94%以上生活在中国[2-3],牦牛可适应海拔3 000 m以上的高寒恶劣环境[4],并利用高原草地资源进行动物性生产。目前,牦牛饲养方式仍以纯天然放牧为主,因高原的冬季寒冷漫长且饲草匮乏,使牦牛在每年的10月到次年的5月都面临着掉膘严重,死亡率高的问题[5]。因此,寻找“科学、生态、标准”的牦牛养殖方式是提高牦牛生产效率的重要途径。

蛋氨酸(methionine)是反刍动物的第一或第二限制性氨基酸,也是反刍动物生长发育与各项生命活动所需的必需氨基酸[6]。蛋氨酸对机体内蛋白质的合成、脂质代谢、DNA甲基化、生物活性化合物前体及氧化还原反应等过程起到重要的调控作用[7-8]。此外,蛋氨酸也可有效提高家畜的生长效率、繁育性能与屠宰性能等[9-11]。反刍动物体内的瘤胃微生物可以降解日粮中的部分蛋白,这使得在饲料中直接添加游离氨基酸或蛋白质的饲喂方式利用率较低,而过瘤胃蛋白质保护技术可有效地降低蛋白质在瘤胃中的降解率,从而提高饲料的利用率[12]。研究表明,日粮添加蛋氨酸可以改善肉牛肠道内微生物氨基酸的组成与流量,从而提高可消化氮与沉积氮,以此提高肉牛的日增重[13-14]。同时,在育肥牛日粮中补充蛋氨酸可以改善其胴体品质,显着影响育肥牛体内氨基酸转运蛋白基因的表达,促进肠道对氨基酸的吸收[15]。此外,蛋氨酸能够调节反刍动物肌内脂肪的沉积,低蛋白的日粮中加入过瘤胃蛋氨酸可以显着影响羔羊肌肉中脂肪的沉积[16]。

以上研究表明,蛋氨酸可以改善反刍动物体内蛋白质与脂肪沉积,还能通过相关通路影响肌细胞的生长发育,但对牦牛肉品质与挥发性风味物质的影响研究较少,因此,本试验通过在牦牛基础日粮中添加不同水平的过瘤胃蛋氨酸(0、5、10、15 g·d-1),探究其对牦牛半腱肌肉品质、挥发性风味物质及脂肪酸组成与含量的影响,旨在为提高牦牛肉品质提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

饲养试验在四川省阿坝州小金县盛源牧业有限公司(东经102°59′,北纬30°35′,海拔2 500 m)完成。本试验选择4岁、体重为(252.79±15.95)kg健康的麦洼公牦牛24头,将其随机分为4组,对照组饲喂基础日粮(CON)、试验一组饲喂基础日粮加5 g·d-1过瘤胃蛋氨酸(RPM1)、试验二组饲喂基础日粮加10 g·d-1过瘤胃蛋氨酸(RPM2)、试验三组饲喂基础日粮加15 g·d-1过瘤胃蛋氨酸(RPM3),试验牦牛均栓系饲养,将过瘤胃蛋氨酸(MetaSmartTM,美斯特,购自安迪苏公司)单独撒在每头牦牛的全混合日粮(TMR)表面进行饲喂。参考中国饲料及营养价值表(2021年第32版)计算,CON组日粮Met水平0.06%,RPM1组日粮Met水平0.19%,RPM2组日粮Met水平0.32%,RPM3组日粮Met水平0.44%。基础日粮由玉米、大豆、豆粕、菜籽粕、玉米胚芽粉、豆壳、玉米秸秆青贮料等组成,每组6个重复,每个重复1头牛。在试验开始之前,所有试验动物均进行免疫驱虫,预饲10 d后舍饲饲养70 d进行屠宰。牦牛采食及增重情况,参考课题组之前的研究[17]。

1.2 样品采集与指标测定

1.2.1 肉品质性状 完成饲养试验后于盛源牧业有限公司完成统一屠宰,参照张瑞等[18]测定方法进行半腱肌样品采集,采集后组织样本真空处理在-20 ℃条件下转运至实验室,用于后续指标测定。

1.2.1.1 pH测定:参照《食品安全国家标准食品pH值的测定》(GB 5009.237—2016)对排酸24 h的样品pH进行测定,每个样品重复测3次,取平均值。

1.2.1.2 肉色检测:屠宰24 h之后,使用色差仪(CHROMA METER CR-400/410,Konica Minolta公司)进行亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)值的测定,每个样品重复测3次,取平均值。

1.2.1.3 蒸煮损失:称取约80 g的长方体肉样称重(m1),放入蒸煮袋后在80 ℃水浴锅中加热,当肉样中心温度70 ℃时,取出肉块冷却至室温,用吸水纸吸干样品表面的水分,再次对肉块进行称重(m2),蒸煮损失计算公式如下:

蒸煮损失(%)=(m1-m2)/m1×100。

1.2.1.4 剪切力:参照《肉嫩度的测定剪切力测定法》(NY/T 1180—2006)对样品剪切力进行测定,每个样品重复测3次,取平均值。

1.2.2 常规营养成分测定

1.2.2.1 水分含量:称取一定质量的肉样(m3),切成约5 mm的肉片,肉样在-80 ℃冰箱中预冷至少4 h后放入冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥24 h,称重(m4),干燥机内的真空度控制在(10±5)Pa,温度为(-50±5)℃,水分含量计算公式如下:

水分含量(%)=(m3-m4)/m3×100。

1.2.2.2 肌内脂肪含量测定:将质量约5 g肉样冷冻干燥后取出称重(m5),将肉样放于100 mL的石油醚中,在110 ℃的条件下,在全自动脂肪测定仪中提取240 min,提取后将肉样在通风橱通风,完成通风后65 ℃烘干4 h称重(m6),粗脂肪含量计算公式如下:

粗脂肪含量(%)=(m5-m6)/m5×100。

1.2.2.3 蛋白质含量的测定:采用杜马斯燃烧定氮法测定冷冻干燥的半腱肌样品蛋白质含量。

1.2.3 挥发性风味物质的测定与成分评价 1.2.3.1 挥发性风味物质测定:风味物质测定参照本团队前期研究的方法[19],具体操作如下:将肉样去除筋膜,切成肉末,称取5 g肉样放入20 mL顶空瓶中,置于孵化器中,插入密封的萃取瓶内,萃取头暴露在瓶内样品上部的顶空中,80 ℃平衡10 min,固相微萃取针头于80 ℃条件下萃取30 min,再进入气相色谱-质谱进样器,进样口温度230 ℃,解吸2 min。

气相色谱条件:使用TG-WAXMSB色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),进样口温度230 ℃,载气为氦气,初始温度为40 ℃,保持3 min,然后4 ℃·min-1的速度升至210 ℃,保持5 min。不分流模式,初始柱温40 ℃,维持时间3 min,再以5 ℃·min-1升温速率升温,维持5 min,载气为氦气(纯度>99.999%),流速1.0 mL·min-1。

质谱条件:接口温度210 ℃,质量扫描范围40～500 m·z-1。

定性分析:所有的化合物经Nist 11谱库检索,选择正反向匹配值均大于800的化合物进行定性分析;采用峰面积归一法[20]计算各物质的相对含量:

I=M/N×100%。

M为各种挥发性成分的峰面积;N为总峰面积。

1.2.3.2 挥发性风味物质的成分评价:采用ROAV法[21]评价各化合物对样品总体风味的贡献程度,在样品中选择OAV值最大为气味贡献程度最高组分,ROAVstan=100,其他成分ROAV计算公式如下:

ROAVs=OAVs/OAVstan×100。

1.2.4 脂肪酸的测定 脂肪酸测定参照Song等[22]的方法,具体操作如下:将0.3 g冷冻干燥的样品粉末放入试管中,在试管中加入1 mL 10 mol·L-1的KOH和8 mL甲醇,放到超声锅中超声20 min,50 ℃水浴30 min,冷却至室温后,加入0.9 mL 12 mol·L-1H2SO4,定时超声10 min,80 ℃水浴加热1 h,冷却至室温后,将溶液转移至5 mL离心管中,加入3 mL正己烷,在涡旋仪中震荡3 min,再转移至转速为3 000 r·min-1的离心机中离心5 min,取上清至5 mL离心管中,加入过量Na2SO4后涡旋振荡1 min,静置5 min,再放入转速为3 000 r·min-1的离心机中离心3 min,用注射器取上清液,在0.22 μm的滤头进行过滤后注射进玻璃上样瓶中,用气相色谱仪(7890B,Agilent Technologies公司)检测。

气相色谱条件:采用HP-88色谱柱(100 m×250 μm×0.2 μm),进样口:240 ℃恒流:1 mL·min-1,分流比:9∶1,检测器温度:240 ℃,空气流量450 mL·min-1,氢气流量40 mL·min-1,尾吹气流量30 mL·min-1。柱箱升温程序为:100 ℃保持3 min,以10 ℃·min-1的速率上升到175 ℃,保持10 min,以5 ℃·min-1的速率上升到210 ℃,保持12 min,再以5 ℃·min-1的速率升到230 ℃,保持10 min。根据峰面积的相对含量(%)对化合物进行定量分析。

1.3 仪器与设备

pH测量仪(Testo 205,testo AG公司)、色差仪(CHROMA METER CR-400/410,Konica Minolta公司)、肉品嫩度仪(Instron4411,Instroncorporation公司)、冷冻干燥仪(FC-40,Atlascopco公司)、全自动脂肪测定仪(FatExtractor E-500,Buchi公司)、杜马斯定氮仪(NDA702,VELP公司)、Trace DSQ型气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS,Thermo公司)、气相色谱仪(7890B,Agilent Technologies公司)。

1.4 数据统计与分析

利用SPSS 20.0统计软件对数据进分析处理,并用Origin软件绘图,用单因素方差分析检验组间差异显着性,当P<0.05时表示差异显着,结果用“平均值±标准差”表示。

2 结 果

2.1 过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质的影响

如表1所示,添加不同水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌的pH、L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度)、蒸煮损失和剪切力无显着影响(P>0.05)。

表1 不同添加水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌肉品质的影响

2.2 过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌养分含量的影响

如表2所示,添加不同水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌的水分含量无显着影响(P>0.05),RPM3组半腱肌肌内脂肪含量显着高于RPM1组与RPM2组(P<0.05),与CON组无显着差异(P>0.05),CON组粗蛋白含量显着低于其他组(P<0.05)。

表2 不同添加水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌营养成分的影响

2.3 过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌风味物质的影响

肉类的风味物质主要由加工过程中的美拉德反应、糖降解、脂质氧化等反应所产生[23-24],如图1所示,本研究共检测出挥发性风味物质42种,CON组32种,RPM1组32种,RPM2组34种,RPM3组31种,其中醛类物质在CON组、RPM1组、RPM2组的含量最高,分别为29.67%、37.04%、34.08%,在RPM3组的含量也相对较高,总计29.13%。如表3所示,4组半腱肌样品中共检验出42种挥发性风味物质,其中醛类9种、烃类9种、酮类6种、醇类9种、酯类3种、酸类2种、其他物质4种。经过ROAV分析,CON组、RPM1组、RPM2组牦牛半腱肌主要挥发性风味物质中壬醛的气味贡献度最大,将其ROAV值定为100,RPM3组气味贡献度最大的挥发性风味物质为1-辛烯-3-醇,将其ROAV值定为100,对其他组分进行ROAV分析,保留ROAV>0.1的化合物,如表4所示,CON组、RPM1组、RPM2组、RPM3组半腱肌样品中ROAV值>1的关键挥发性风味物质分别有9种、11种、9种、10种。

图1 四组半腱肌挥发性风味物质的种类(a)和相对含量(b)Fig.1 Types (a) and relative contents (b) of volatile flavor compounds in four groups of semitendinosus muscle samples

表4 四组牦牛半腱肌挥发性风味物质的ROAV分析

2.4 日粮添加不同水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌脂肪酸含量的影响

根据表5所示,四组半腱肌样品中共检测出16种脂肪酸,包括3种饱和脂肪酸、6种单不饱和脂肪酸和7种多不饱和脂肪酸;半腱肌CON组饱和脂肪酸总量显着低于RPM1组和RPM2组(P<0.05),其中RPM1组与RPM2组棕榈酸含量显着高于其他组(P<0.05),且RPM1组、RPM2组与RPM3组的饱和脂肪酸总量与棕榈酸含量均呈现下降趋势,RPM1组二十二碳酸含量显着高于CON组和RPM3组(P<0.05);RPM1组单不饱和脂肪酸总量着高于RPM2组与RPM3组(P<0.05),其中RPM1组肉豆蔻油酸含量显着低于其他组(P<0.05),且RPM1组、RPM2组与RPM3组的肉豆蔻油酸含量呈上升趋势,CON组十七碳烯酸含量显着高于其他组(P<0.05),RPM1组二十四碳烯酸含量显着高于RPM2组(P<0.05);半腱肌各组间多不饱和脂肪酸总量无差异(P>0.05)。以脂肪酸为衡量标准,RPM1组的脂肪含量分布合理,肉质较好。

表5 日粮添加不同水平过瘤胃蛋氨酸对牦牛半腱肌脂肪酸组成和含量的影响

3 讨 论

3.1 肉品质与养分含量

在本研究中,肉的食用品质是衡量现代肉类食品经济效益的重要部分,它可以有效反映肉的消费性能和潜在价值[25]。从理化性质来讲,pH、肉色、蒸煮损失、剪切力可以很好的反映肉品品质[26],其中,pH可以直接影响肉类的口感、嫩度、肉色、风味等指标[27],并且肉类pH过高不利于其存储与运输,而过低的pH又容易造成肉类变质,研究表明,刚屠宰的肉pH较高,范围在6～7之间,为了提高肉类的品质需要将刚屠宰的肉排酸24 h后食用口感会更佳[28],而排酸后的肉pH在5.1～5.6之间,此外,pH异常还会影响肉类的嫩度和颜色[29],但屠宰24 h后pH在5.8以下可以避免肉质出现问题[30]。上述研究表明,pH是肉质品质、口感及风味的关键影响因素。本课题组前期的研究发现,饲料中添加过瘤胃蛋氨酸可以有效地提高牦牛的生长性能与饲料转化率[31]。在本研究中,通过不同水平的过瘤胃蛋氨酸添加饲养,牦牛半腱肌肉样品的pH均在5.1～5.6之间,其肉品质良好。结果表明,在牦牛日粮中添加过瘤胃蛋氨酸对牦牛生长性能的提升并不影响牦牛肉品质,未来可用作牦牛饲料添加剂进行加工和推广。

肉色是消费者对肉品质好坏的第一感官印象,肉色的变化主要与肌红蛋白、血红蛋白及Fe2+相关[32-34],研究表明,家畜在被屠宰后肉中存在着天然的还原系统,而还原系统会将肉中的Met Mb在有氧条件下被还原,从而引起肉色的改变[35]。此外,牦牛的肉色普遍深于其它牛类,这可能与高海拔的生活环境有关。本研究发现,添加不同水平过瘤胃蛋氨酸对各组半腱肌样品蒸煮损失均无显着影响,但RPM1组与RPM2组的蒸煮损失在数值上高于其他组,研究表明肉类的抗氧化能力与蒸煮损失呈负相关[36],因此推断,过瘤胃蛋氨酸的添加对牦牛肉抗氧化能力具有潜在影响。有研究发现,蛋氨酸在动物组织蛋白质的合成中发挥着重要的调节作用[37]。而本研究发现,日粮中添加不同水平的过瘤胃蛋氨酸可以有效提高牦牛半腱肌的蛋白质含量,这与Fleming等[38]关于过瘤胃蛋氨酸的生物利用度研究结果一致,同时也表明过瘤胃蛋氨酸可能通过促进肌红蛋白和血红蛋白的生成,从而提升牦牛肉色品质。肌肉的剪切力与肌内脂肪、甘油三酯含量呈负相关,剪切力值越小,肌肉的嫩度越高,口感越好,越受消费者的喜爱[39-40]。本研究发现,当过瘤胃蛋氨酸含量添加至15 g·d-1时,肌内脂肪含量显着升高,这表明日粮中添加过瘤胃蛋氨酸有效提高了牦牛半腱肌脂肪含量,可在一定程度上提升牦牛肉的口感。

3.2 挥发性风味物质

阈值与含量的高低决定了挥发性风味物质对样品的贡献度,通过分析挥发性风味物质的ROAV值发现,壬醛对CON组、RPM1组、RPM2组的风味贡献度最大,壬醛具有柑橘香气与油脂香气,1-辛烯-3-醇对RPM3组的风味贡献度最大,1-辛烯-3-醇具有偏肉香的蘑菇味。如表4所示,四组半腱肌样品共有的关键挥发性风味物质为:庚醛、十二醛、正辛醛、壬醛、正己醛、正己醇、正庚醇、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃。

本研究发现,醛类物质为牦牛半腱肌的主体风味物质,醛类物质主要源于脂肪酸受热降解、氧化,具有脂肪与水果香气等[22]。由表3可知,3-甲基-2-丁烯醛是RPM1组与RPM3组特有的物质,随着过瘤胃蛋氨酸含量的增加,牦牛半腱肌样品中醛类物质的含量也随之增加,在RPM1组达到最高值后开始下降,说明日粮中加入适量过瘤胃蛋氨酸可以增加牦牛半腱肌醛类物质的含量与种类。研究表明,肉类中醛类化合物的含量较高,但其阈值较低,使得ROAV值较高,本研究中结果表明其对肉类的风味形成具有较大的贡献,与董卓琪等[23]的研究结果一致。醛类物质主要源于脂肪酸的氧化[41],本试验检测发现,牦牛半腱肌样品中含有亚油酸与亚麻酸,样品中部分关键性醛类物质可能是由于亚油酸和亚麻酸氧化而形成[42],其中苯甲醛具有苦杏仁味,RPM1组的苯甲醛含量显着高于其他组,这可能与牦牛体内的脂肪累积和一些不饱和脂肪酸的沉积有关,其余醛类物质由于其含量较低或觉察阈值较高导致其对牦牛半腱肌的风味无明显的贡献作用。RPM2组的庚醛含量显着高于其他组,这可能与日粮中添加了10 g·d-1的过瘤胃蛋氨酸有关,庚醛具有油脂香味与柑橘香味,对RPM2组样品的贡献度较高。本研究中,RPM1组的饱和脂肪酸含量显着高于CON组,RPM1组的单不饱和脂肪酸显着高于RPM2组与RPM3组,这可能是RPM1组醛类物质含量高于其它组的原因之一。

本研究发现,牦牛半腱肌样品中含有较高含量的醇类物质,其中1-辛烯-3-醇、正庚醇、正己醇对四组半腱肌样品的贡献度较高,醇类物质可以提供清香、醇香和蘑菇香,对肉类的风味具有重要意义。本试验中,CON组、RPM1组、RPM2组、RPM3组醇类物质含量分别为22.97%、20.07%、26.32%、29.44%,随着过瘤胃蛋氨酸含量的增加,牦牛半腱肌样品中醇类物质的含量降低,在RPM1组达到最低值后开始上升。研究表明,部分醇类物质是由脂肪氧化产生[43],本研究中RPM3组的脂肪含量显着高于RPM1组与RPM2组,这与醇类物质含量的变化一致,说明日粮添加适量的过瘤胃蛋氨酸可以增加醇类物质的含量,这可能与牦牛半腱肌脂肪含量增加有关,但具体调控机制需要更进一步研究证明。此外,从四组样品中发现,RPM1组的关键挥发性风味物质种类最多,与其他3组相比,RPM1组的关键挥发性物质中含有正辛醇,使得RPM1组具有独特水果香味与坚果味,这可能与日粮中加入了5 g·d-1的过瘤胃蛋氨酸有关。

相对而言,烃类物质普遍具有较高的觉察阈值,且烃类物质的来源与醛类物质相似,均由脂肪酸烷氧基的均裂而产生[44]。在本研究中,烃类物质普遍含量较低,ROAV值较低,使得其对牦牛半腱肌的风味几乎没有贡献度,RPM2组的醇类物质与烃类种类最多,这种变化可能与营养水平差异有关,研究表明,脂肪酸是重要的风味前体[45],本研究中日粮添加不同水平的过瘤胃蛋氨酸显着提高了牦牛半腱肌肉的脂肪酸含量,脂肪酸含量的增加可能影响风味物质的组成与含量的变化,因此,RPM2组醇类物质与烃类种类增加可能与日粮中添加了10 g·d-1的过瘤胃蛋氨酸有关。酮类、酸类等物质在4组样品中均有检出,由于其含量偏低,种类较少,大部分对风味贡献程度低。

3.3 脂肪酸组成

当样品中PUFA/SFA值高于0.4被认为该肉品的品质较高[46],本试验中,半腱肌的不饱和脂肪酸含量均高于饱和脂肪酸,且PUFA/SFA值高于0.4,这说明牦牛半腱肌肉品质较高,这与测定pH、肉色等试验的结果一致。刘德强等[47]研究表明,日粮中添加过瘤胃蛋氨酸可以提高奶牛的乳脂率,这可能与过瘤胃蛋氨酸影响脂肪酸合成有关,在本试验中,日粮中添加过瘤胃蛋氨酸显着增加了牦牛半腱肌的饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸总含量,且RPM1组的饱和脂肪酸总含量与单不饱和脂肪酸总含量最高,这可能与脂肪的沉积、瘤胃生物氢化作用等相关。棕榈酸是组成牛乳脂的重要脂肪酸[48],并且棕榈酸对机体内能量的分配也有一定影响,在本试验中,日粮中添加过瘤胃蛋氨酸可以极显着提高棕榈酸的含量,且RPM1组与RPM2组的棕榈酸含量增加的效果最明显。

不饱和脂肪酸在加工过程中更容易被氧化成醛类、酮类等挥发性化合物,这是牦牛半腱肌拥有独特脂肪风味的重要原因之一[42],不饱和脂肪酸有益于人类健康,能够降低人动脉粥样硬化,增加身体免疫力[46],在本试验中,牦牛半腱肌的不饱和脂肪酸含量远高于饱和脂肪酸,且在日粮中加入过瘤胃蛋氨酸可以提高牦牛半腱肌的不饱和脂肪酸的含量与种类,这表明日粮添加过瘤胃蛋氨酸可以提高牦牛半腱肌的营养价值,对牦牛机体的健康有一定的益处。综上所述,日粮中添加过瘤胃蛋氨酸能够不同程度地提高牦牛半腱肌中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量与种类,从而改善牦牛肉脂肪酸组成。

4 结 论

本试验结果表明,日粮中添加过瘤胃蛋氨酸可以有效提高牦牛半腱肌肉品质,增加其风味物质的丰富度与脂肪酸含量,从而提高牦牛肉的适口性,其中补饲量为10 g·d-1和5 g·d-1时,牦牛半腱肌的肉品质、风味丰富度、脂肪酸含量与组成更佳。