王巍炜，洪志鹏，李高峰△，王绍佳，陈瑞彬，张继朋

（1.昆明医学院第三附属医院胸外科／云南省肿瘤医院肺癌研究中心 650118；2.昆明医学院第一附属医院胸外科 650032；3.昆明医学院第三附属医院妇科肿瘤科 650118）

宣威地区一直是西南、乃至全国的肺癌高发地区，其发病率和病死率一直高居不下，肺癌防控面临着严峻的挑战。前期研究发现宣威地区肺腺癌患者中survivin高表达，研究人员利用survivin反义核苷酸（ASODN）抑制宣威肺腺癌细胞取得了较好的效果［1－2］。在前期研究基础上本研究采用体外培养宣威肺腺癌细胞XWLC-05细胞皮下接种法，在裸鼠体内建立皮下宣威肺腺癌细胞XWLC-05细胞移植瘤模型。通过皮下移植瘤内多点注射，观察survivinASODN对肺癌移植瘤生长影响的情况，为下一步临床研究提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 survivinASODN的合成和主要试剂 参照文献［3］针对位于survivinmRNA 232～251bp处的序列，合成ASODN：5′-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3′和 正 义 寡 核 苷 酸（SODN）：5′-CAA GGA GCT GGA AGG CTG GG-3′。序列两端碱基经硫代修饰对抗核酸酶的降解，经计算机网上检索证实与survivin以外的己知人类基因无同源性。序列由上海生物

1.7 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件包处理数据。计量数据均以±s表示。各组间比较应用方差分析最小显着差法（F检验，α＝0.05），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组裸鼠一般情况 整个实验期间4组裸鼠未出现死亡，大、小便及饮食情况正常，活动度等未出现其他明显的异常情况。处死后对各组裸鼠心脏、肝脏、肾脏进行病理检查均没有发现明显变性坏死表现。

2.2 裸鼠肿瘤的体积及生长指数变化情况 survivinASODN治疗组其肿瘤生长速度较为缓慢，其中部分裸鼠表现为肿瘤停止生长，甚至其中3只出现肿瘤退缩消失。治疗结束后survivinASODN注射组瘤体的肿瘤大小明显低于其他3组，而其他3组相似。survivinASODN治疗组肿瘤生长指数为（2.78±0.27），远远低于对照组（5.71±0.31）、LIP组（6.21±0.23）和survivinSODN组（5.69±0.37），见图1。

2.3 裸鼠肿瘤的质量变化及抑瘤率情况 末次survivinASODN注射后第2周以脱臼法断颈处死所有荷瘤裸鼠，提取肿瘤并且称取质量。可以发现survivinASODN注射组瘤体的肿瘤质量为（1.06±0.04）g，低于对照组（2.22±0.03）g、LIP组工程公司帮助合成。细胞培养采用RPMI-1640培养基（Gibeo公司）；新生小牛血清采用杭州四季青生物公司产品。

1.2 细胞培养 选取云南宣威肺腺癌细胞株XWLC-05，由昆明医学院第一附属医院临床医学实验研究中心提供。将其于－80℃冰箱中将保存后取出、后培养、传代，最后将处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 移植瘤裸鼠模型的建立 4～6周龄BALB／C裸小鼠，体质量18～22g，雌、雄均可，购于昆明医学院动物中心，饲养于SPF级无菌饲养室，自由摄取食物和水。采用培养细胞皮下接种移植法。对XWLC-05细胞常规传代培养1个月左右，于接种当日收集大量的培养细胞后，立即接种，接种细胞数量为2.0×106（约0.5mL悬液），用1mL注射器将单细胞悬液注射于裸鼠左前腋侧皮下。

1.4 实验分组及survivinASODN注射 将一批实验用裸鼠接种后至肿瘤最长径达8～10mm时，随机挑选其中48只，随机分4组，每组12只。对照组：予生理盐水处理；单纯脂质体转染（LIP）组：予等量的脂质体转染液处理；survivinSODN组：予600nmol／L survivinSODN 脂质体复合物处理；survivinASODN组：予600nmol／L survivinASODN脂质体复合物处理。各组分别于成瘤分组后每隔48h按直接移植瘤内多点注射1次，共注射5次。

1.5 XWLC-05裸小鼠皮下移植瘤体积、质量及肿瘤生长抑制率的测定 分别于每次注射前用游标卡尺测量肿瘤最长径和最短径，并称体质量。于末次survivinASODN注射后第2周以脱臼法断颈处死所有荷瘤裸鼠，取移植瘤测量肿瘤最长径（a）和最短径（b），按公式v＝ab2／2计算肿瘤体积，计算肿瘤生长指数：（V治疗后－V治疗前）／V治疗前。称取瘤结节质量，以瘤结节质量计算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（对照组质量－实验组质量）／对照组质量×100%。

1.6 一般状况观察及组织学检查 观察包括裸鼠的饮食、大小便、精神状况等。处死裸鼠后标本固定后，留取心脏、肝脏、肾脏和肿瘤组织用4%多聚甲醛固定后在光镜下观察肿瘤细胞坏死、凋亡、炎症反应等改变。（2.61±0.04）g和survivinSODN 组（2.69±0.05）g，survivin ASODN抑瘤率为（37.26±1.92）%，见图2。

图1 survivinASODN转染对裸鼠移植瘤肿瘤生长指数的影响

图2 survivinASODN转染对裸鼠移植瘤肿瘤质量的影响

2.4 survivinASODN转染对裸鼠肿瘤组织的影响 对照组、LIP组和survivinSODN组细胞体积大，大小不等，胞浆丰富，胞核大，深染，核分裂相多见，偶见瘤巨细胞。而survivinASODN处理组XWLC-05细胞形态与其他3组相似，但瘤组织中有大量的细胞坏死灶，结缔组织增生，炎症细胞浸润明显。

3 讨 论

survivin基因是在人类基因组文库中筛选克隆出IAP家族的一个新成员，在多种肿瘤中均有表达［4－5］。前期研究表明，和其他肿瘤细胞中情况相似［6－7］，通过对特定靶向基因的survivin的反义抑制，可以影响其基因、蛋白的表达，可抑制宣威肺腺癌细胞XWLC-05增殖并诱发其凋亡，从而抑制其生长［8］。本研究采用动物实验的方法进一步研究survivinASODN对小鼠宣威肺腺癌转移瘤的干预作用。采用反义技术，针对survivin基因232～251bp处的序列，合成反义寡核苷酸，并且采用脂质体包裹、硫代磷酸修饰后将其直接多点注射于宣威肺腺癌细胞XWLC-05裸鼠皮下移植瘤内。肉眼观察发现survivinASODN组的肿瘤生长比较缓慢，其中部分裸鼠表现为肿瘤生长缓慢或者停止生长，甚至其中3只裸鼠出现肿瘤退缩消失。测量结果也显示survivinASODN组瘤体生长指数（2.78±0.27）低于与对照组、LIP组和survivnSODN组。处死所有荷瘤裸鼠称取其肿瘤质量。可以发现survivinASODN注射组瘤体的肿瘤质量为（1.06±0.04）g，低于其他3组，其抑瘤率高达（37.26±1.92）%。显微镜下观察显示，ASODN组液化坏死灶增多，凋亡细胞增加。提示，survivinASODN对宣威肺腺癌细胞XWLC-05裸鼠移植瘤产生了明显的抑制作用，结合相关研究和本研究结果推测可能是由于survivinASODN干扰survivin的表达或抑制其功能的发挥，从而抑制有丝分裂并促进自发细胞凋亡，使肿瘤生长速度延缓，瘤体质量减轻［9－10］。整个实验过程中4组裸鼠均没有出现死亡，大小便及饮食情况没有发现明显异常，处死后各组裸鼠心脏、肝脏、肾脏均没有发现明显变性、坏死表现。提示脂质体、反义核酸对于裸鼠是安全的，这可能由于survivin仅特异性地表达于肿瘤组织［11－12］，而survivinASODN治疗具有良好的靶向性、特异性，其对正常组织影响较小。

survivinASODN处理宣威肺腺癌细胞裸鼠肺癌细胞XWLC-05移植瘤后，肿瘤的生长明显受到抑制，未出现明显不良反应，提示在宣威肺腺癌中采用反义核苷酸治疗是安全、可行的［13－15］，为下一步临床治疗提供了思路和实验室资料。

［1］ Wang WW，Li GF，Hong ZP.The effect of the exression of Survivin antioligonucleotide on the apoptosis of Xuanwei lung adenocarinome cell［J］.Chinese-German Journal of Clinical Oncoloy，2011，10（5）：252-255.

［2］ 王巍炜，李高峰，洪志鹏，等.宣威昆明两地区肺腺癌中survivin表达的比较研究［J］.医学研究杂志，2010，39（7）：61-62.

［3］ 1saka T，Maruno M，Nakata H，et al.Effeetiveness of spray application of ACNU in the local of malignant gliomas：report of two case［J］.Neurol Res，2002，22（2）：181-184.

［4］ 邓开，王洪林.survivin基因在肿瘤中的研究进展［J］.重庆医学，2008，37（10）：1111-1113.

［5］ 刘敏，李萍，兰显国，等.Survivin和VEGF在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义［J］.重庆医学，2010，39（10）：1231-1232.

［6］Semenza GL.Regulation of Oxygen Homeostasis by Hypoxia-Inducible Factor 1［J］.Physiology，2009，24（2）：97-106.

［7］ 李玉华，宫向前，邢建华，等.Survivin反义核酸对大肠癌HT229细胞化疗的影响［J］.中华肿瘤防治杂志，2006，13（21）：1620-1622.

［8］ Shen C，Duck A，Polat B，et al.Triplex forming cligodeoxy-nucleotides targeting Survivin inhibitor proliferation and induce apoptosis of human lung carcinomar cells［J］.Cancer Gene Ther，2003，10（5）：403-410.

［9］ 王志成，王海霞，郭德玉，等.survivin反义核酸抑制胶质瘤细胞增殖的实验研究［J］.重庆医学，2008，37（22）：2570-2574.

［10］Shen C，Duck A，Polat B，et al.Triplex forming cligodeoxy-nucleotides targeting Survivin inhibitor proliferation and induce apoptosis of human lung carcinomar cells［J］.Cancer Gene Ther，2003，10（5）：403-410.

［11］Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas［J］.Clin CancerRes，2000，6（1）：127.

［12］Falleni M，Pellegrinii C，Marchetti A，et al.Survivin gene ex-pression in early stage non small cell lung cancer［J］.J Pathol，2003，200（5）：620-626.

［13］Lehner R，Bobak J，Kim NW，et al.Localization of telomerasehtert protein and Survivin in placenta：relation to placental development and hydatidiform mole［J］.Obstet Gynecol，2001，97（6）：965-970.

［14］孙顶，蔡建明，祝宝让，等.STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用［J］.第二军医大学学报，2011，32（1）：76-79.

［15］Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural functional and therapeutic biology of Survivin［J］.Cancer Lett，2006，244（2）：164-171.