段湘兰 谢果珍 刘叶蔓.*
（1 湖南省农科院职工医院，长沙410125；2 湖南中医药大学，长沙410128）
凹叶厚朴 Magnolia officinalis Rehd. et Wils. Subsp.biloba(Rehd. et wils.)Law为木兰科落叶乔木，其药用有效成分主要为厚朴酚及和厚朴酚。凹叶厚朴在20a左右成材入药。近年来，野生资源濒临枯竭，凹叶厚朴已被列为国家Ⅲ级保护植物。植物是重要的天然药物资源，应用植物细胞悬浮培养技术可批量生产有用的植物药物及其次生代谢物质。通过细胞悬浮培养生产大量成分均一的植物细胞培养物，是解决药用植物资源匮乏的理想途径，这一技术，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。而以培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究又成为这一领域的新热点[1-2]。本文作者前期对凹叶厚朴组织培养试验结果表明，在凹叶厚朴愈伤组织中，有效成分的含量甚微[3]，限制了凹叶厚朴的生物技术利用。本试验在此基础上开展凹叶厚朴的悬浮细胞培养及其生理特性研究，为建立凹叶厚朴高产细胞系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 以凹叶厚朴茎段诱导愈伤组织，继代培养半年[3]，选择质地疏松、生长旺盛的愈伤组织作为试验材料。
1.2 方法
1.2.1 种子细胞的培养 称取愈伤组织4g，用镊子夹碎接种于 100ml新鲜的液体培养基中，培养基配方为B5+1.5 mg／L NAA+0.5mg／L 6-BA，蔗糖 20g/ L。培养8 d后，先用40目纱网过滤去除大的细胞团，然后按1:3体积转入新鲜培养液，继代培养4d后，再用80目纱网过滤。将含较小细胞团的滤液经4次继代培养后，获得较均一的细胞悬浮培养物，以此作为悬浮培养的种子细胞。
1.2.2 不同植物生长调节剂对细胞生长的影响 选用L9（34）正交设计，根据实验号分别考察IAA、NAA、6-BA和KT四个因素对凹叶厚朴细胞生长的影响，基本培养基为B5。因素水平见表1，按表2各实验号的搭配顺序，取“1.2.1”中培养的细胞种子液，接种到表2培养基中，每瓶10ml，每隔4d按 1：3的体积更换新鲜培养液继代1次，继代培养 3次后，通过过滤的方法获得培养细胞，测其细胞鲜重，每组重复3次，取平均值。
表1 正交设计因素水平表
1.2.3 不同初始接种量对凹叶厚朴细胞生长的影响 分别吸取“1.2.1”中的细胞种子液2、4、6、8、10ml接种到 B5+0.5mg／L IAA +0.1mg／L NAA+0.1mg／L6-BA+0.5mg／L KT，蔗糖20g／L的液体培养基中，研究不同初始接种量对细胞生长的影响。
1.2.4 不同蔗糖浓度对凹叶厚朴细胞生长的影响 分别设置蔗糖浓度为 15、20、25、30、35、40g／L 6个水平，取“1.2.1”中细胞种子液 6ml接种到“1.2.3”液体培养基中，研究不同蔗糖浓度对细胞生长的影响。
1.2.5 不同pH值对细胞生长的影响 分别设置 pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共 5个水平，培养基中蔗糖浓度为 20g／L，研究不同 pH值对细胞生长的影响。
1.3 培养条件 以上试验如无特殊说明，均采用 150ml三角瓶，装液量 40ml，摇床转速 120 r／min，pH 值 6.5，培养温度（23±2）℃，黑暗条件下培养。鲜重的测定方法及培养周期均同1.2.2。
2 结果与分析
2.1 不同植物生长调节剂对凹叶厚朴悬浮细胞生长的影响 经过3次继代培养后，各组培养基中凹叶厚朴悬浮细胞均有较明显增加，试验结果见表2，在9个试验号中，1和5号培养基中凹叶厚朴细胞增加比较多，8号培养基中凹叶厚朴细胞增加最多。同时，随着细胞生长，细胞的聚集度也慢慢地提高，出现大颗粒细胞团。极差分析表明，这4种因素对凹叶厚朴悬浮细胞生长的影响程度依次为 6-BA＞NAA＞KT＞IAA，最优组合是A3B2C1D3，即：B5+1.5mg／LIAA+0.3mg／LNAA +0.1mg／L6-BA +1.5mg／LKT。
表2 L9(34)正交实验结果
2.2 不同初始接种量对凹叶厚朴细胞生长的影响 接种量分别为2、4、6、8、10ml种子液，收获的细胞鲜重分别为10.55g/L、13.43g/L、15.34g/L、22.30g/L、17.21g/L，结果表明，8ml接种量收获的细胞最多，为 22.30g/L。低于这个接种量，细胞生长缓慢，当接种量达到 10ml时，细胞生长迅速，但随着细胞的迅速生长，大颗粒细胞团增加，细胞的生长量反而较低。
2.3 不同蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响 蔗糖对凹叶厚朴悬浮细胞生长的影响随着浓度的不同而表现出较大差异。蔗糖浓度为 15、20、25、30、35、40 g／L 6个水平的细胞收获量分别为 11.53g/L、12.03g/L、14.34g/L、15.74g/L、13.70 g／L、11.25g／L。在蔗糖浓度 30g／L以下，细胞的生长量随蔗糖浓度的提高而增加，30g／L蔗糖对细胞生长的影响最大，细胞鲜重为15.74g／L，当蔗糖浓度进一步提高，细胞生长量的积累则呈下降趋势，细胞有褐化现象。
2.4 不同pH值对凹叶厚朴悬浮细胞生长的影响 pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共 5个水平，细胞收获量分别为9.25g/L、11.34g/L、11.33g/L、17.65g/L、9.70 g／L。不同pH值对细胞生长的影响差异较大，pH值过低或过高都不利于凹叶厚朴细胞的生长，在5个水平中pH值为6.5最适合细胞生长。
3 讨论
通过极差分析发现，四种激素对凹叶厚朴悬浮细胞生长的影响程度依次为 6-BA＞NAA＞KT＞IAA，6-BA是影响凹叶厚朴悬浮细胞生长的主要因素。作者在前期阶段的试验中[3]，利用了比较高的6-BA浓度，并与NAA搭配使用，在凹叶厚朴悬浮细胞培养中，这种协同作用的促进依旧，同愈伤组织诱导一样，效果较好。
许多植物细胞培养试验结果表明，初始接种量对细胞的增殖有明显的影响。植物细胞具有群集效应，只有当接种量达到一个临界值时，细胞的生长量才显着增加。当低于这临界值时，生长缓慢；高于临界值时，由于细胞密度过大，分裂快，导致培养液中的养分很快被消耗殆尽，同时容易积累有害物质，导致细胞衰老，抑制细胞的生长，细胞的生长量也会逐渐减少，本试验中最佳的接种量为8ml。
蔗糖是植物赖以生长的重要碳源和渗透压调节剂，对细胞的生长和形态的发生具有十分重要的作用。当蔗糖浓度较低时，细胞的生长量较小，主要受能源物质和碳源供给的限制，此时渗透势的调节则处于次要地位。随蔗糖浓度的提高，能源物质和碳源供给达到饱和，这时蔗糖浓度再进一步提高，仅起到调节培养基渗透压的作用。高糖带来的培养基高渗透压不仅对其他营养物质的吸收有抑制作用，还可造成细胞内含水量下降，从而影响细胞的生长。
笔者的研究结果表明，在pH值为6.5时，凹叶厚朴悬浮细胞生长量达到最大，在pH值为5.5和6.0时，细胞的生长量基本相同，说明在一定范围内细胞具有一定的自身调节能力，但在pH值为7.0和5.0时，细胞生长量都很低。由此看来，凹叶厚朴的细胞生长需要微酸性环境，在微酸性环境下，细胞对pH值有一定的调节作用，但超过这个范围，pH值将会明显的影响细胞的分裂生长。pH值对植物细胞的影响有很多方面，包括引起质膜通透性变化，影响植物细胞对一些物质的吸收以及植物细胞的代谢等。通过对其动态变化的研究，可以人工添加适量酸碱值稳定剂，使培养液pH值始终维持在有利于细胞生长的范围内，从而获得更大生长量。
[1]陈文源,吕一婷.药用植物细胞悬浮培养与新药研发进展(综述)[J].亚热带植物科学,2009,38(4):85-88.
[2]李冬杰,魏景芳,刘淑清.药用植物细胞悬浮培养研究进展[J].河北林业科技,2003,8(4):22-23.
[3]刘叶蔓,赵碧清,曾婷.凹叶厚朴愈伤组织的诱导及其有效成分含量的比较[J].中国药房,2008, 19(18):1393-1395.
