李海霞，周 民，周有君，常 依，王雅露
（湖南省儿童医院，湖南 长沙 410007）
水牛角为牛科动物水牛（Bubalus bubalisLinnaeus）的角，可作为中药犀角的代用品。水牛角始载于梁·陶弘景《名医别录》，味苦、咸，性寒，归心、肝、胃经，专入血分，为治血热毒盛之要药，临床常用于治疗血热出血证。但其止血作用机制及有效成分尚不明确[1-2]。以往学者大多采用药理实验研究水牛角主要成分，发现水牛角含有胆甾醇、强心成分、蛋白质、肽类、氨基酸及钙盐。水牛角粉及水牛角煎液中含有镁、磷、钠等元素以及硅、铁、锰、锌、铜、铝、钛等微量元素[3-5]。有研究发现水牛角水解物在体外能够抗炎、止血，且有一定诱导血小板聚集的作用[6-8]。本课题组前期研究以干姜水煎剂为造模用药，建立了大鼠血热出血模型，故本研究采用大鼠血热出血模型研究水牛角的止血功效和作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（350±50）g，8～9周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SYXK（湘）2020-0012。湖南省儿童医院儿科医学研究所动物房饲养。湿度50%～55%，温度22～24 ℃，定期更换垫料，自由饮食，适应性饲养4 d。医学实验遵循有关实验动物管理和使用的规定。本实验已通过湖南省儿童医院医学伦理委员会审查（批件号：HCHLL-2020-36）。
1.2 药物 水牛角饮片（批号：201911902）、干姜饮片（批号：1812020242）均购自湖南三湘中药饮片有限公司，经戴冰主任药师鉴定，水牛角为牛科动物水牛BubalisLinnaens的角，干姜为姜科植物Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎，质量均为优。云南白药（云南白药集团股份有限公司，批号：ZLA1811）；无水乙醇（郑州派尼化学试剂厂，批号：181216）。水牛角水煎液制备：在水牛角中加入双蒸水500 mL，砂锅武火熬开后，文火熬30 min，去上沫，再煮30 min，倒出上清液；再煎煮一次，两次液体混合。离心10 min（3 000 r/min，离心半径为30 cm），调配至质量浓度分别为3.60、1.80、0.90 g/mL，于4 ℃冰箱保存备用。
干姜水煎液制备：将干姜饮片（适量）加10倍水浸泡后，武火煮开，文火煎煮1 h，趁热过滤，同上操作再煎煮2次之后，3次滤液混合至一起浓缩至1.5 kg/L，即为干姜水煎剂，冷冻保存，备用。
云南白药生理盐水溶液配制：将4 g的云南白药以无菌生理盐水将原液稀释为50 mg/mL。
1.3 试剂 HE染色液（上海埃彼化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，湖北威德利化学试剂有限公司，批号：14S002）；10%水合氯醛（湖南省儿童医院药房配制）；苏木素-伊红染色液（批号：P032IH）、中性树胶（批号：P033IH）均购自Auragene；二甲苯（批号：10023418）、无水乙醇（批号：10009218）均购自国药集团。
1.4 主要仪器 SSW-600-2S型电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；YT-6C型生物组织摊烤片机（湖北孝感分析试剂公司）；P031IH防脱载玻片（Auragene）；AE41光学显微镜（美国Motic）；AG135电子天平（梅特勒-托利多）；M1ii1-Qadvantage自动双重纯水蒸馏器（贝徕美生物科技有限公司）；可调式移液器（德国Eppendorf公司）；5810R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；LMQ.C立式高压蒸汽灭菌器（山东新华医药公司）；BJH-30P陶瓷自动中药煲（潮州市科力电器有限公司）。
1.5 分组与造模 将60只SD大鼠随机分为正常对照组、出血模型组、云南白药组、水牛角高剂量组、水牛角中剂量组、水牛角低剂量组，每组10只。除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠以5%乙醇代替自由饮水，并灌胃干姜水煎液（15 g/kg），复制血热出血模型[6]。正常对照组自由饮水，并灌胃等体积蒸馏水。
1.6 实验给药 根据前期预实验结果设置各组给药剂量。造模6 h后，云南白药组灌胃云南白药溶液，0.5 g/（kg·d）。水牛角高、中、低剂量组大鼠分别灌胃高、中、低剂量的水牛角水煎液，剂量分别为36.0、18.0、9.0 g/（kg·d）。正常对照组、出血模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，10.0 mL/（kg·d）。1次/d，连续14 d。
1.7 观察指标
1.7.1 一般体征 给药前、给药后（第14天），24 h之内监测代谢笼中各组大鼠饮水量、摄食量、尿量及粪便量的变化，继续观察24 h，计算各组大鼠每100 g体质量的上述指标平均值；并于每组大鼠各取新鲜粪便1粒，先测湿质量，再置于105 ℃的烘干箱5 h，冷却后测干质量。粪便含水量=[（湿质量-干质量）/湿质量]×100%；体质量增长率=（给药后体质量-给药前体质量）/给药前体质量×100%。
给药前、给药后清晨分别测定大鼠肛温。
1.7.2 凝血功能 末次给药1 h后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手术台上切开腹腔找到腹主动脉，用采血管穿入其中，每只大鼠取10 mL血液，3.8%枸橼酸钠（1∶9）抗凝，4 ℃，3 000 r/min（离心半径30 cm）离心10min，取血清，测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白降解产物（FDP）、抗凝血酶Ⅲ（AT）。
1.7.3 肺组织、胃组织病理学变化 大鼠取血后处死，取右叶肺、胃组织，10%多聚甲醛溶液固定48 h，用全自动生物组织脱水机进行脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木精和伊红（HE）染色，光镜观察拍片。
1.8 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，符合正态分布且方差齐，计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般体征 出血模型组大鼠肛温高于正常对照组（P＜0.01），体质量增长率、摄食量、饮水量、尿量、粪便量及粪便含水量均低于正常对照组（P＜0.01）；云南白药组大鼠肛温低于出血模型组（P＜0.05），体质量增长率高于出血模型组（P＜0.01）；水牛角高、中剂量组大鼠肛温低于出血模型组（P＜0.01或P＜0.05），体质量增长率、摄食量、饮水量、尿量、粪便量及粪便含水量均高于出血模型组（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高剂量组大鼠肛温低于云南白药组（P＜0.01）；水牛角高、中剂量组大鼠摄食量、饮水量、尿量、粪便量及粪便含水量均高于云南白药组（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高剂量组大鼠体质量增长率、摄食量、饮水量、尿量、粪便量及粪便含水量均高于水牛角低剂量组（P＜0.01或P＜0.05）。（见表1）
表1 各组大鼠一般体征比较 （）
表1 各组大鼠一般体征比较 （）
注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与出血模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与云南白药组比较，dP＜0.05，eP＜0.01；与水牛角低剂量组比较，fP＜0.05，gP＜0.01。
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2.2 各组大鼠凝血功能比较 出血模型组大鼠PT、APTT均低于正常对照组，FIB、TT均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。云南白药组大鼠TT、FIB均低于出血模型组（P＜0.05）；云南白药组大鼠PT、APTT与出血模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。水牛角高、中剂量组大鼠PT、APTT均高于出血模型组，FIB、TT均低于出血模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角低剂量组大鼠FIB低于出血模型组（P＜0.01）；水牛角低剂量组大鼠PT、APTT、TT与出血模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。水牛角高剂量组大鼠PT、APTT高于云南白药组（P＜0.05）；水牛角高、中剂量组大鼠PT、APTT高于水牛角低剂量组，FIB低于水牛角低剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高剂量组大鼠PT、APTT、TT、FIB与水牛角中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）
表2 各组大鼠凝血功能指标比较 （）
表2 各组大鼠凝血功能指标比较 （）
注：与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与出血模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与云南白药组比较，eP＜0.05；与水牛角低剂量组比较，fP＜0.05，gP＜0.01。
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2.3 各组大鼠FDP、AT比较 出血模型组大鼠FDP、AT高于正常对照组（P＜0.01）；云南白药组大鼠AT与出血模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；云南白药组大鼠FDP低于出血模型组（P＜0.01）；水牛角高、中剂量组大鼠FDP、AT均低于出血模型组（P＜0.01）；水牛角低剂量组大鼠FDP、AT与出血模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。水牛角高剂量组大鼠FDP、AT低于云南白药组（P＜0.01）；水牛角中剂量组大鼠AT低于云南白药组（P＜0.05）；水牛角中剂量组大鼠FDP与云南白药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。水牛角高、中剂量组大鼠AT、FDP低于水牛角低剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高剂量组大鼠FDP、AT与水牛角中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）
表3 各组大鼠FDP、AT 比较 （）
表3 各组大鼠FDP、AT 比较 （）
注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与出血模型组比较，bP＜0.01；与云南白药组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与水牛角低剂量组比较，eP＜0.05，fP＜0.01。
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2.4 大鼠肺组织病理学变化 正常对照组大鼠肺泡、支气管及肺间隔基本正常。出血模型组大鼠肺泡结构明显被破坏，肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔少量红细胞浸润，伴炎症细胞浸润。与出血模型组比较，云南白药组、水牛角低剂量组、水牛角中剂量组、水牛角高剂量组大鼠肺出血表现均不同程度减轻，尤其以水牛角高剂量组最明显。水牛角高剂量组大鼠肺泡结构相对完整，肺间质及间隔出血、肺泡壁显着改善，未见明显炎症细胞浸润。云南白药组、水牛角中剂量组可见部分肺泡结构破坏，肺间质和间隔少量出血，纤维组织少量增生，可见少量炎症细胞浸润。水牛角低剂量组以上情况稍有改善，但不明显。（见图1）
图1 各组大鼠肺组织病理图 （HE，×100）
2.5 大鼠胃组织病理学变化 正常对照组大鼠胃黏膜基本正常。与正常对照组比较，出血模型组大鼠胃黏膜水肿、充血、炎症细胞浸润，固有层中性粒细胞浸润，胃底腺有少量不规则现象，主细胞和壁细胞数明显减少。与出血模型组比较，云南白药组、水牛角低剂量组、水牛角中剂量组、水牛角高剂量组大鼠胃黏膜损伤有不同程度减轻，尤其以水牛角高、中剂量组改善明显。（见图2）
图2 各组大鼠胃组织病理图 （HE，×100）
3 讨论
研究发现，清热类中药可在炎症反应环节发挥保护血管内皮细胞、抗感染作用[9-11]，但水牛角的清热止血作用机制尚不清楚。本实验采用干姜水煎液灌胃并以5%乙醇代替自由饮水，建立大鼠血热出血模型。结果显示，模型大鼠体质量、摄食量等减少，肺组织、胃组织出血，并且大鼠PT、APTT缩短，FIB含量增加，TT延长，AT、FDP升高，表明血热出血模型复制成功。
血液黏度是反映血液在血管中流动是否通畅的指标。血液黏度高和血流速度变慢，则容易发生血栓或栓塞性疾病，从而导致血液淤滞、血溢脉外而出血[12-13]。常见原因有血细胞数量增多，红细胞变形性差，血小板数量增高及黏附性增强等，或血浆中溶质成分改变，如血糖、血脂、纤维蛋白原浓度升高等[14]。本实验中，血热出血模型组大鼠饮水量、摄食量明显减少，尿量、粪便含水量及体质量增长率均明显下降，全血黏度及血浆黏度显着增加，表明干姜之辛热能入血分，耗伤津液，导致全血黏度增加、凝血功能异常，引起DIC倾向；而高、中剂量的水牛角水煎液和云南白药可改善大鼠饮水量、摄食量等一般体征，降低FIB、AT、FDP，延长PT、APTT，缩短TT，使全血及血浆黏度下降，改善血液流动性。而低剂量水牛角水煎液对以上指标改善不明显，提示水牛角的清热止血作用与剂量密切相关。本实验结果显示，水牛角高、中剂量组大鼠FDP、AT均低于出血模型组，表明水牛角水煎液能通过调整纤溶系统的动态平衡，改善肺组织和胃组织出血等病理损伤，从而综合发挥止血作用。与既往学者研究发现一致[2，15]。
关于水牛角的成分，有研究采用超高效液相色谱-四极飞行时间质谱法（UHPLC Q-TOF-MS）结合主成分分析法（principal component analysis, PCA）对水牛角、羚羊角、山羊角、牛角骨的角蛋白进行分类，并找出其标记肽段而进行鉴定。结果表明，每个样品的标记肽隐藏在大量的胰蛋白酶肽中，4种样品的四基峰离子（BPI）图谱非常相似[16]。近红外光谱技术结果显示，水牛角水解过程中脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的浓度最高[17-18]；且水牛角与羚羊角均含有酰胺基团、CH基团和Ca3（PO4）2混合物[19]。因此，水牛角的抗血栓、抗凝血作用，可能与其含有的多肽段及氨基酸成分有关[20-22]。水牛角发挥止血的具体机制及成分有待于进一步研究。
