五福饮口服液的提取工艺研究

刘效栓，李喜香，李季文，毕映燕，钱梦茹

甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050

五福饮口服液原方出自张仲景《景岳全书·新方八阵》卷五十一方之五福饮，由人参、当归、熟地黄、炒白术、炙甘草等5味药物组成，主治五脏气血亏损，在防治人类亚健康方面有较大开发前景。本研究拟将传统五福饮汤剂制备成五福饮口服液，通过单因素试验及中心组合设计-效应面法对五福饮口服液的提取工艺进行优化，选取最佳提取工艺参数，为防治亚健康的五福饮口服液保健品开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 UV1800型紫外-可见分光光度仪（SHIMADZU）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平AR522CN、AR124CN（上海奥豪斯仪器有限公司）；鼓风式干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 试药 人参、当归、熟地黄、炒白术、炙甘草饮片（甘肃省中医院药学部提供）；人参皂苷Re（中国食品药品检定研究院，批号：20140901）；D-无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号：20140715）；95%乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇（天津富宇精细化工有限公司）；无水乙醇、浓硫酸、冰乙酸、高氯酸（天津百世化工有限公司）；试验用水为自制蒸馏水。

2 方法与结果

按处方量（人参12.0 g，当归18.0 g，熟地黄18.0 g，炒白术 9.0 g，炙甘草 6.0 g）称取药材，以浸泡时间、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，加水回流提取，过滤，收集合并滤液，将滤液浓缩至一定量，测定干膏得率、总多糖含量、总皂苷含量。

2.1 干膏得率测定方法 取蒸发皿干燥恒重，将10 mL浓缩液转移至蒸发皿，于烘箱（105℃）中烘3小时后取出，转移至干燥器中，放置恒温，称重［1-4］。干膏得率（g/g）=（10 mL 浓缩药液干燥后所得干膏量×10）/63。

2.2 总多糖含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 称取D-无水葡萄糖适量，精密称定，配制成每毫升含0.100 0 mg溶液，精密量取50 μL该溶液至50 mL容量瓶，加水稀释至刻度，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 量取浓缩药液10 mL，加入95%乙醇溶液，使体系含醇量达到60%，置于-4℃冰箱内，冷藏醇沉，24小时后取出抽滤，烘干。将全部沉淀溶解至25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容摇匀，备用。量取上述溶液0.1 mL，稀释至10 mL，即为供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液 200、400、600、800、1 000 μL 于 6 支干燥具塞试管中，不足1 mL者加蒸馏水补足1 mL，依次加入6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15分钟后取出立即放入冰水浴10分钟后取出，室温放置15分钟，照中国药典Ⅰ部附录V A紫外-可见分光光度法，于485 nm处测定吸光度（A）值，以A值为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，并绘制标准曲线，所得回归方程：

2.2.4 方法学考察 考察该方法的精密度、稳定性、重复性、加样回收率，其RSD分别为1.50%、1.78%、0.95%、1.13%，说明方法可行。

2.2.5 样品的测定 量取供试品溶液1.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，摇匀，沸水浴15分钟，冰水浴10分钟，室温放置15分钟，于485 nm处测定吸光度（A）值。将吸光度（A）值代入回归方程计算得样品中总多糖含量［5-8］。

2.3 总皂苷含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 称取人参皂苷Re适量，精密称定，配制成每毫升含0.004 0 mg溶液，备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 量取5 mL浓缩药液，加入无水乙醚萃取3次，20 mL/次，弃乙醚层，水层加水饱和的正丁醇萃取3次，30 mL/次，合并正丁醇层，并以适量浓氨水将正丁醇层洗涤2次，将洗涤后的正丁醇层溶液转移至旋转蒸发仪，蒸干溶剂，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.3 标准曲线的绘制 精密吸取 50、100、200、300、400、500 μL人参皂苷Re对照品溶液（浓度为0.0040 mg/mL）分别置于6支干燥具塞试管中，挥干溶剂后加入0.5 mL 0.2%香草醛-高氯酸溶液，混合均匀后，置于60℃恒温水浴15分钟，取出立即用冰水冷却2分钟，加入77%硫酸溶液5 mL，取出放置至室温，消除汽泡后照紫外可见分光光度法，于535 nm处测定吸光度，并以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，并绘制标准曲线，回归方程为Y=0.001X+0.115（R=0.999）。

2.3.4 方法学考察 考察该方法的精密度、稳定性、重复性、加样回收率，其 RSD 分别为 1.25%、1.39%、1.90%、1.26%，说明方法可行。

2.3.5 样品的测定 精密吸取样品溶液100μL，置于100mL具塞试管中，后续处理方法与绘制标准曲线时操作相同，照中国药典Ⅰ部附录VA紫外-可见分光光度法，于535 nm处测定吸光度（A）值。将吸光度（A）值代入回归方程计算得样品中总皂苷含量［9-12］。

2.4 提取工艺的单因素试验 根据文献［13］、［14］、［15］确定浸泡时间、提取时间、提取次数、加水量为五福饮口服液提取工艺的影响因素。本试验按处方量（人参12.0 g，当归18.0 g，熟地黄18.0g，炒白术9 g，炙甘草6.0 g）称取药材，以浸泡时间、料液比、提取时间、提取时间次数为考察因素，加水回流提取，过滤，收集合并滤液，将滤液浓缩至一定量，测定干膏得率、总多糖含量、总皂苷含量。从而初步确定各因素水平。

2.4.1 浸泡时间 按处方量称取药材4份，分别加入630 mL水（10 倍），置于圆底烧瓶中，分别浸泡 0、15、30、60 分钟，回流提取1小时，过滤，收集滤液，滤液浓缩至 100 mL。按照“2.1”“2.2”“2.3”项下操作方法测定干膏得率、总多糖、总皂苷含量。结果可见，随着浸泡时间的延长，各指标含量呈上升趋势，浸泡至60分钟含量最高，但与30分钟时含量相差较小，综合考虑时间成本与各指标成分的提取量，确定浸泡时间为30分钟，见表1。

表1 不同浸泡时间各指标含量测定结果

2.4.2 提取时间 称取处方量药材4份，编号1-4，置于圆底烧瓶中，分别加入630 mL水（10倍），浸泡30分钟后，1-4号分别回流提取0.5，1，2，3小时，过滤，收集滤液，滤液浓缩至100 mL。分别按照“2.1”“2.2”“2.3”项下操作方法测定干膏、总多糖、总皂苷含量，结果可知，提取1、2、3小时的各指标含量较提取0.5小时含量高，但互相之间差异不大，因此提取时间需由进一步的试验来确定，见表2。

表2 不同提取时间各指标含量测定结果

2.4.3 提取次数 称取处方量药材1份，编号1-4，每份含人参 12.0g，熟地黄 18.0g，当归 18.0g，炒白术9.0 g，炙甘草6.0 g，置于圆底烧瓶中，浸泡30分钟后，回滤液流提取，每次所得滤液单独收集，第1次提取结束，过滤后加入630 mL水（10倍）提取第2次，以此类推，共提取4次，过滤，分别收集每次滤液，均浓缩至100 mL。分别按照“2.1”“2.2”“2.3”项下操作方法测定干膏、总多糖、总皂苷含量，结果可知，第4次提取所得干膏得率、总多糖含量、总皂苷含量仅占4次总量的2.58%，5.56%，2.71%，可知经 2 次提取后，各指标含量提取量在90%以上，可认为已提取完全，故将提取次数确定为2次，见表3。

表3 不同提取次数各指标含量测定结果

2.4.4 加水量 称取处方量药材4份，置于圆底烧瓶中，分别加入相当于药材重（61 g）8、10、12、14倍的水，煎煮3次，2 h/次。合并煎煮液，浓缩至 100 mL。分别按照“2.1”“2.2”“2.3”项下操作方法测定干膏、总多糖、总皂苷含量。结果可知，在加水量的试验中，除8倍溶剂所得干膏、总多糖、总皂苷的含量较低外，其余10、12、14倍溶剂评价指标含量相差不大，需由进一步试验确定，见表4。

表4 不同加水量各指标含量测定结果

2.5 提取工艺的优化

2.5.1 中心组合设计-响应面法试验设计 由以上数据及图表分析，确定试验浸泡时间为30分钟、提取次数为2次，并选定各影响因素的水平。由于单因素试验研究难以反映多个因素之间相互作用对提取工艺的影响，因此需要结合中心组合设计-响应面试验对提取时间、加水量进行进一步考察，再根据中心组合设计得出的结果综合分析确定。故研究拟采用中心组合设计-响应面法优化提取工艺［16-18］，以干膏得率、总多糖含量、总皂苷含量的综合评分为指标，考察提取时间、加水量等因素，因素水平见表5。

表5 五福饮口服液提取工艺因素-水平

2.5.2 中心组合设计-响应面试验结果 按照“2.5.1”项下方法对提取工艺进行优化，结果见表6。以Design-Expert 8.05 b软件分析，所得方差分析结果见表7，响应面结果见图1—2。

表6 中心组合设计-响应面试验结果

表7 中心组合设计-响应面试验回归方程方差分析

图1 提取时间和料液比对综合评分的等高线

图2 提取时间和料液比对综合评分的响应面

由表7可以看出，该模型失拟项显着（P＜0.05），决定系数（P＞0.05）不显着，证明该模型拟合度和可信度较好。另外，因素A、A2、B2对统计结果影响显着，因素B和交互项AB影响不显着，说明该模型可用于五福饮口服液提取工艺的优化。

利用响应面和等高线分析各因素的相互作用，等高线密度大说明影响因素对响应值贡献大。并且等高线的形状可直观看出交互效应的大小，椭圆形反映了两因素交互作用较强，呈圆形则相反，而响应曲线较陡说明交互作用较强。从图1可看出等高线呈椭圆形，说明影响因素提取时间（A）与料液比（B）交互作用较明显。响应面图可知该模型有稳定点，且稳定点是最大值。

利用Point Prediction进行预测分析，获得一组响应值最大的优化条件：提取时间A为136.3分钟，料液比为10.79，在此优化条件下，R为0.831。根据得到的最优条件，并且考虑到实际操作的可行性，将五福饮口服液的提取条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：浸泡30分钟，提取2次，提取时间A为120分钟，料液比B为11倍，在此条件下提取，依法计算综合评分值，对预测结果进行3批验证，综合评分结果为0.828（n=3）。预测值与实际值之间偏差较小，说明二次多项式数学模型所得到的优化条件符合设计目标，试验设计和数学模型可靠且重现性良好。

2.6 提取工艺验证试验 根据中心组合设计-响应面法的预测结果，同法做3批验证试验，结果表明，综合评分的平均值为0.828，实际值与预测值较为接近，该方法可用于五福饮口服液的提取，见表8。

表8 提取工艺验证试验结果

3 讨论

中心组合设计-响应面优化法是将中心组合设计试验得出的数据结果进行响应面分析后，描绘出响应-考察因素曲面图，预测模型一般是一个连续的曲面。从响应曲面上选择最优的响应区，确定自变量的取值范围，即可确定最佳试验条件，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续地对试验自变量的各个水平进行分析［19］。该方法所采用的模型为非线性数学模型，在中心点进行重复性试验，以此提高试验精度，试验次数少、预测性良好、可信度较高。

本试验研究了五福饮口服液的提取工艺，通过单因素试验选取2个影响因素，建立影响因素与响应值（干膏得率、总多糖含量、总皂苷含量三者的综合评分为响应值）相互作用的数学模型，绘制响应曲面图，通过建立目标函数的二次回归方程，预测最佳提取工艺，试验结果与函数预测值一致。