王 峥，李建鹏，张 翥，彭贵军
(1. 河南中医药大学第一附属医院,郑州 450000； 2. 河南省中医院,郑州 450002)
糖尿病肾病的发生发展是多因素综合作用的结果，病理改变主要有肾小球高滤过、肾小球基底膜增厚、微量白蛋白尿滤出、肾功能下降至终末期肾衰竭，其确切发病机制至今尚未阐明。随着学者们对炎症因素在糖尿病肾病发生发展中作用机制的认识，以及抗炎治疗在动物模型中取得成功的例子，阻断免疫炎症将可能成为治疗糖尿病肾病的新手段。本研究通过观察复方积雪草颗粒积芎解毒方对糖肾大鼠模型肾组织炎症因子含量水平的影响，探讨对糖肾大鼠的肾保护作用及可能机制，以期为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级健康雄性 SD 大鼠 60 只，体质量(200±20)g，由河南省动物实验中心提供(动物许可证号SCXK(豫)2010-0002)。
1.2 药物与试剂
积芎解毒方中药颗粒剂(由积雪草、川芎、黄芪组成，江苏江阴天江药业有限公司生产，批号1607090)；福辛普利片(上海中美施贵宝公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、24 h尿蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔多克隆抗体NF-κB(美国abcam公司)；兔多克隆抗体AngⅡ(美国abcam公司)；羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；蛋白分子量标准Marker(美国Sigma公司)；RNA 提取试剂盒(北京天根生物有限公司)；反转录试剂盒(美国Thermo公司)；SYBR Green 定量PCR 试剂盒(美国Invitrogen公司)。
1.3 动物分组、造模及给药方法
60只大鼠随机选取10 只为正常对照组，普通饲料喂养，余大鼠给予高糖高脂饲料喂养，给予 2% 链脲菌素(STZ) 60 mg·kg-1的剂量一次性腹腔注射，正常对照组则注射等量的枸橼酸缓冲液。大鼠自由饮水进食 72 h 后，尾静脉全血血糖≥ 16.7 mmol·L-1作为糖尿病模型造模成功的标准。正常喂养4周后 24 h尿蛋白定量(UTP) ≥30 mg 者判定糖尿病肾病大鼠造模成功，纳入实验。造模成功大鼠随机分为模型对照组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、福辛普利组各10只。
根据陈奇主编《中药药理学研究方法》，将积芎解毒方中药颗粒(黄芪30 g,川芎20 g,积雪草30 g)用三蒸水溶解配制成高浓度生药0.5 g/ml，中浓度生药0.25 g/ml，低浓度生药0.125 g/ml，按2 ml/100 g·d-1剂量分别给予高、中、低中药剂量组大鼠灌饲，福辛普利组给予福辛普利 0.167 mg /100 g·d-1灌饲，正常对照组与模型对照组大鼠每日予生理盐水2 ml/100 g·d-1剂量灌饲，连续给药8 周。第8周末代谢笼收集24 h尿液，后处死大鼠取血；取肾皮质0.2 g，制成匀浆液保存于-80 ℃冰箱中备用。
1.4 生化指标检测
大鼠的血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)、24 h尿蛋白定量(UTP)等采用自动生化分析仪测定。
1.5 Real time PCR技术检测各组肾组织核因子Kappa B(NF-кB)、血管紧张素-Ⅱ(AngⅡ)mRNA 的表达
取肾皮质，采用Trizol法提取总RNA进行RNA 的浓度测定，然后经反转录合成cDNA进行PCR 反应。PCR 反应条件: 95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s， 60℃30 s，扩增50 个循环。以β-actin 为内参，采用△△Ct 法进行相对定量分析，以2-△△Ct作为目的RNA 的相对表达量。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计提供，引物序列: β-actin引物上游：5'-AGG CCG GCT TCG CGGGCG AC-3'，下游：5'-CAG GGG AGC CACACG CAG CTC-3'，扩增判断243 bp；NF-кB引物上游：5'-TCAGACACCTTTGCACTTGG-3'，下游：5'-GATAAGGAGTGCTGCCTTGC-3'，扩增判断187 bp；AngⅡ引物上游：5'-GCCAGATACTGCGAAAGCATGA -3'，下游：5'-GCTTCCATTCGCACCACAGA -3'，扩增判断186 bp。
1.6 Western Blot技术检测各组肾组织NF-кB、AngⅡ蛋白的表达
肾组织匀浆离心后去上清液，采用BCA法测定蛋白定量，处理后的蛋白样品SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移至PVDF转印膜，以标准蛋白Marker为参照，依分子量大小切取条带，5%脱脂奶粉封闭。一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育，化学发光试剂显色，用扫描仪扫描特异性蛋白条带。利用Image J 图像分析系统读取内参β-actin及目的蛋白条带的平均灰度值，目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学方法
2 结果
2.1 各组大鼠生化指标比较
表1显示，与模型对照组比较，各治疗组UTP明显下降，TP、ALB 均明显升高，其中中药高剂量组优于低剂量组(P<0.01)，与福辛普利组相似(P>0.05)，中药中剂量组与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中剂量组与高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，各组ALT、AST变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 各组大鼠生化指标比较
注：与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01; 与中药高剂量组比较:△P<0.05.
2.2 各组大鼠肾组织NF-KB、AngⅡ表达比较
图1 各组NF-KB、AngⅡ蛋白免疫印迹条带图
表2图1显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾组织NF-кB KB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表达显着升高(P<0.01)；与模型对照组比较，各治疗组NF-кB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表达均明显降低，其中中药高剂量组优于低剂量组(P<0.01)，与福辛普利组相似(P>0.05)，中药中剂量组与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中剂量组与高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
表2 各组肾组织NF-кB、AngⅡ mRNA、蛋白表达比较
注：与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01; 与中药高剂量组比较:△P<0.05
3 讨论
中医古籍虽未见糖尿病肾病这一疾病名称，但从其临床表现及发展机制来看，属于中医“消渴”“水肿”等范畴。中医认为，禀赋不足、饮食不节、劳欲过度、情志失调为糖尿病肾病的病因。其病理机制关键是本虚标实，本虚为气血、阴阳、五脏之虚，标实为水湿、瘀血、痰浊等病理产物。中医药在糖尿病肾病的治疗中已积累了较丰富的经验，特别是在延缓糖尿病肾病病程进展，提高生存质量等方面具有一定的优势[1]。有资料表明，中医药在治疗糖尿病肾病有一定疗效，且能减缓西药副作用，延缓终末期肾脏病的发生，但仍有不足。如治疗方案多样化、不统一、小样本观察病例研究为多，可比性、重复性差，缺乏循证医学多中心大样本协作研究，药物作用机理研究少等。因此借助现代生物学技术，加强基础研究，筛选有效的中药制剂是防治糖尿病肾病的重要目标。本研究小组依据各家[2-3]及前期临床经验研究[4-5]，总结本病以气虚瘀毒为主要病机特点，在疾病的不同发展阶段，病机的侧重点也不尽相同，总属本虚标实，确立“益气活血解毒”作为各期的基本治法，选用多年临床总结的积芎解毒方作为基础治疗方案。其组方为黄芪、川芎、积雪草，以黄芪益气健脾补肾治疗糖尿病肾病之本虚；以川芎活血祛瘀通络，积雪草清热利湿、解毒消肿治疗糖尿病肾病之标实。现代药理研究证实，黄芪对肾小球基底膜电荷屏障和机械屏障均有保护作用[6]，从而减轻通透性蛋白尿，并可改善局部血流动力学异常，减轻或延缓肾功能进展。川芎可用于机体免疫调控，改善高凝状态，减轻肾小球病理损害，降低慢性肾衰竭大鼠肾组织中TGF-β1的表达,延缓慢性肾衰竭的进展[7]。积雪草可抑制肌成纤维细胞的增生、聚集，抑制肾小管上皮细胞中TGF-β1的表达，减轻肾小管间质的损伤，发挥抗肾纤维化作用[8-9]。
糖尿病肾病被认为是一种炎症性疾病[10-11]，目前发现的糖尿病肾病炎症信号传导通路主要有MAPK信号传导通路、TLR信号传导、NF-kB抑制物激酶(IKK)/NF-kB信号通路等，通过各种炎症因子如NF-кB、AngⅡ、TGF-β1、MCP-1等在这些通路中起主要介导作用，参与庞大复杂的免疫炎症反应过程[12-14]，最终引起不同程度的肾脏损害。NF-кB在细胞因子网络调节中发挥转录调控作用，糖尿病状态下葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖基化终末产物生成、多元醇途径活性增强等均可导致NF-кB激活、堆积，NF-кB活化后能诱导许多炎症因子的转录，诱导蛋白尿增加、肾小球硬化及小管间质纤维化[15]。AngⅡ不仅是一种血管活性因子，与高糖具有协同效应，还作为一种炎症因子，通过与靶细胞表面的特异性受体结合，使靶细胞核内转录因子的活性改变，通过激活NF-кB促进MCP-1的合成，参与肾脏组织中单核细胞的募集反应，介导肾组织的炎症反应，是影响慢性肾脏病预后的重要环节之一[16]。
本实验结果显示，糖尿病肾病模型对照组大鼠肾组织内炎症因子NF-кB、AngⅡmRNA和蛋白的表达水平明显高于正常组，表明糖尿病肾病时炎症信号传导通路的激活以及各种细胞因子的介导，调节着糖尿病肾病进展中炎症反应过程。积芎解毒方高剂量组可下调糖尿病肾病大鼠肾组织炎症因子的表达，具有降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白、提高血清蛋白的作用，与福辛普利组作用相似，且没有明显的肝损。提示积芎解毒方对糖尿病肾病大鼠的肾保护作用，可能与抑制炎症信号传导通路的激活、降低免疫炎症反应、从而延缓肾功能进展有关，但其具体作用机制还需进一步探讨。
