程礼敏
（皖南医学院形态学实验实训中心，安徽 芜湖241002）
0 引言
蛋白C抗凝系统是维持机体内凝血与抗凝血系统相对稳定状态的重要组成部分，蛋白C抗凝系统系统主要包括：蛋白C、蛋白C抑制物、蛋白S、血栓调节蛋白以及内皮细胞蛋白C受体。内皮细胞蛋白C受体不仅在机体的抗凝过程中起作用[1]，同时参与了机体的炎症反应和免疫应答[2-3]，在细胞保护等方面也具有重要意义。
1 蛋白C抗凝系统各组分的生理结构
1.1 蛋白C（protein C，PC）
PC由肝脏合成，以无活性的酶原形式分泌到血浆，是一种依赖维生素K的双链糖蛋白，蛋白C分子由一条轻链和一条重链经单一二硫键连接而成。PC灭活FVa和FVIIIa的丝氨酸蛋白酶活性位点位于重链，当PC的重链氨基端上一个小肽段被切下时，就变成一种活化的蛋白C（APC），具有丝氨酸蛋白酶的活性。具体生物学特性详见后述。
1.2 蛋白C抑制剂（protein C inhibitor，PCI）
PCI是一种依赖肝素的丝氨酸蛋白酶抑制剂，发现于人的血浆、尿液和多种体液中。结构多样，PCI分子由387个氨基酸残基组成，活性中心是Arg354-Ser355。PCI抑制谱广泛，不仅能抑制APC，还能灭活凝血因子Xa、凝血酶、胰蛋白酶等。Geiger[4]在1996年发现PCI在体内的分布存在种族特异性，在人体中，PCI作为一种血浆蛋白，广泛表达于多种组织器官，但也在男性生殖器官中高浓度存在，却只表达于小鼠的生殖系统上，提示PCI在生殖过程中的作用，涉及人类生殖的几个步骤，包括受精过程，而且在不同物种间的调节作用存在差异。
1.3 蛋白S（protein S，PS）
蛋白S是一种依赖维生素K的血浆糖蛋白，以350nM左右的浓度循环于血浆中。人体循环血浆中，大约60%的PS通过高亲和力、高分子量复合物与补体调节蛋白C4b结合，形成C4BP结合蛋白。PS具有多种抗凝特性，杂合子蛋白S缺乏症与静脉血栓形成风险增加相关。人和小鼠纯合子缺乏症与胎儿期严重血栓形成、血管系统发育缺陷等有关。除了抗凝作用，蛋白S还影响C4BP的补体调节特性，而且与TAM家族的酪氨酸激酶受体相互作用[5]。
1.4 血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）
TM是PC的活化辅助因子，是一种表达于血管内皮细胞上的跨膜糖蛋白。含有577个氨基酸残基，主要构成1个氨基端的C型凝集素区和6个EGF样结构域。 当TM与凝血酶结合，形成T-TM复合物后，凝血酶的促凝活性即可转化为抗凝活性，导致凝血酶对蛋白C的激活的级联反应被大大的加速；与此同时，TM能加速凝血酶激活纤溶抑制物的活化，而起到抑制纤溶反应的作用。已证实TM存在于所有血管内皮细胞中，脑血管除外[6]。现对于血浆可溶性TM作为血管内皮细胞损伤的标志已经达成共识。TM在多种恶性肿瘤中均呈现出特异性的表达，提示TM还可能参与了肿瘤的发生发展[7]。
1.5 内皮细胞蛋白C受体（endothelial cell protein C receptor，EPCR）
EPCR分子属于跨膜蛋白，是与PC/APC具有高度亲和力的内皮细胞表面受体。EPCR在体内的表达存在组织特异性，主要表达于大血管以及大部分小动、静脉的内皮细胞表面[8]。EPCR可在蛋白S的辅助下灭活因子Va和VIIIa，发挥抗凝作用。同时EPCR结合APC后可通过蛋白酶活化受体1（PAR-1）的介导而触发抗凋亡作用，还可抑制中性粒细胞的激活以及在组织损伤部位的外渗，导致细胞表面的黏附分子CD11b/CD18的表达受到抑制；继而炎症细胞因子合成及释放减少而发挥抗炎作用。此外，EPCR是造血干细胞（HSC）的表面标志物之一，可被用于HSC的分选和纯化。EPCR可通过PAR-1信号通路等途径，参与HSC及其微环境的调节，介导HSC在骨髓中的保留和造血功能的重建[9]。
2 蛋白C抗凝系统的生物学功能
蛋白C抗凝系统的终产物均为活化蛋白C（APC），其各组分发挥生物学功能都将依赖于APC。临床上运用APC治疗，可能对创伤性脑损伤具有重要的治疗潜力，在脑卒中模型中具有神经保护作用，APC可改善脑损伤后功能的转归，并能促进缺血后新生血管和神经发生，它还能促进血管生成、存活和神经原细胞从小鼠脑室室管膜下区向周围区域迁移，但这些大脑修复机制的确切作用仍有待确定[10]。此外，不同的研究揭示了PC/APC在肥胖、肺炎、弥散性血管内凝血、阿尔茨海默病、中风等疾病中的潜在作用。
2.1 抗凝作用
APC的抗凝活性主要通过以下三种途径：（1）APC在Ca2+存在时，在PS的协助下依赖其丝氨酸蛋白酶活性裂解FVa和FVIIIa的重链，降低其与磷脂的结合力，影响FII的形成，从而阻止凝血过程的发展；（2）FXa与血小板的结合需要FVa作为媒介，APC灭活FVa后阻碍了FXa与血小板的结合，对凝血级联反应进行负反馈调节[11]；（3）APC通过灭活纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）的活性以及阻止TAFI的生成，进而诱导t-PA的释放，起到促纤溶作用。APC作为一种“按需”抗凝血剂，减少凝血酶的形成，它的抗凝活性还具有种专一性。血浆APC或PC水平的降低与静脉血栓栓塞的风险增加相关。据大样本统计，PC系统的功能障碍是东北亚地区静脉血栓性疾病发生的最主要的遗传风险因素[12-13]。
2.2 抗炎作用
APC可以直接抑制炎症介质的释放而发挥直接抗炎作用，且不依赖于其抗凝活性，还可通过EPCR依赖性方式发挥间接抗炎作用。研究证明[14]，单核细胞上的Mac-1通过与EPCR的结合，可作为蛋白C发挥抗凝和抗炎作用的感受器，促使两大生理功能相互协调整合，从而能够更好地发挥保护机体的作用。多项体内外研究表明[15-17]，APC的直接抗炎作用是通过下调炎症因子、趋化因子以及黏附分子的表达，降低白细胞的趋化性、调节白细胞与内皮细胞间的相互作用而达到的。
2.3 抗凋亡作用
APC可以直接改变细胞的基因表达，而不依赖其抗凝活性。APC可直接作用于人脐静脉内皮细胞，NFKB信号传导通路被阻断，凋亡相关基因的mRNA及其转录产物表达受抑，而抗凋亡基因表达增加，从而发挥抗凋亡作用。Domotor团队[18]的研究表明，APC的抗凋亡特性由丝氨酸蛋白酶功能区与EPCR及PAR-1信号通路共同参与，APC通过EPCR介导降解PAR-1，导致人脑内皮细胞中的Ca2+内流减少而起到抗细胞凋亡的作用。
2.4 APC与脓毒血症
近年关于PC系统与脓毒血症的报道中证实[19-20]，在脓毒血症发生发展过程中，患者常合并凝血系统不同程度的功能紊乱，PC系统发挥了重要的作用。在病程发展的早期，表现为凝血系统的激活及血液呈高凝状态，APC不仅发挥抗凝作用，还能有效改善微循环，增加供氧量，延缓器官衰竭；重症时表现为弥散性血管内凝血。同时，APC有对抗缺血/再灌注（I/R）损伤的作用。Schoots等[21]在肠I/R损伤模型中观察到，APC通过抗凝和抗炎的联合作用可减轻I/R的损伤，保护肠道屏障功能。Heuer[22]在大鼠脓毒症动物模型中证实，动物在感染后20h，肝脏组织PC mRNA的表达明显下降，转录水平选择性地降低，PC表达下降，TM、EPCR下调均可引起循环血液中的APC浓度降低，从而加速脓毒症的进展。通过大量的活体动物实验表明[23]，利用活化蛋白C治疗可减少细胞因子的生成，抑制白细胞粘附，减轻病理损害的程度。APC对脓毒症的防治作用，可能是抗凝、抗炎、改善微循环、保护器官等多种效应协同作用的结果。APC具有细胞保护功能，它的治疗用途已经在严重脓毒症中得到了评估，并且正在评估它在一些具有重要炎症成分的疾病中的治疗作用。
3 蛋白C系统各组分的分子缺陷
3.1 PC的分子缺陷
PC基因定位于2号染色体（2q13～q14），共有10 802个碱基，含有9个外显子和8个内含子。基因突变种类300多，突变类型以常染色体显性遗传多见，也有隐性遗传，且目前没有发现明显的种族及地区差异。临床上将遗传性PC缺陷症分为两型：I型中，PC活性和PC水平，二者均降低；II型中存在PC分子缺陷，仅PC活性下降，PC水平正常。在I型中，60%以上为错义突变，由于这些氨基酸的置换导致PC与其他残基相互作用被改变，干扰蛋白的折叠，致使蛋白快速地在细胞间降解。导致II型PC缺陷症的突变均是错义突变，突变多发生在蛋白的功能区。同时PC血浆水平还受基因多态性的调节[24-25]。
3.2 PS的分子缺陷
PS基因定位于3号染色体（3q11.1～3q11.2），由两个高度同源性基因组成：PSα和PSβ。自1984年首次报道PS缺陷症以来，迄今已报道的PS基因突变有200多种，为常染色体显性遗传。以I型杂合子型多见，在I型基因缺陷中已知有片段缺失、框架移位等，累及1～15外显子。II型较为少见，其基因突变位于前肽的第一、二类表皮生长因子区。Hurtado等[26]分析12种与PS缺乏相关的天然PROS1突变在基因和蛋白质表达上的功能相关性，发现PS缺乏的主要原因是突变蛋白质的合成、稳定性或分泌缺陷。目前关于PS缺陷的报道只局限于散在的病例研究，还有关于PS与PC的联合缺陷的个案报道[27]，但都缺乏大规模的病例对照研究，其与血栓性疾病发病的相关性有待进一步的探索。
3.3 TM及PCI的分子缺陷
多项研究表明[28-30]，TM基因的编码区和调控区含有突变位点或基因多态性，与脑出血、冠状动脉硬化以及血栓性疾病有密切关系，可溶性血栓调节蛋白浓度调节了脑梗死的风险和预后。但具体的基因突变对生理功能的影响，由于样本量的不足或是地域、种族差异，至今仍没有统一结论的报道。目前关于PCI基因突变的研究主要集中在与生殖系统的关系上，突变导致基因表达的蛋白质发生空间结构上的变化，引起男性精子的产生、发育以及成熟均发生障碍，从而造成男性不育[31]。
3.4 EPCR的分子缺陷
人体EPCR基因位于20号染色体q11.2，包含3个内含子和4个外显子。基因突变影响EPCR蛋白分子的表达，依赖EPCR的PC活化功能受到损伤，可能与动静脉血栓形成有关[32]。此外，基因多态性与蛋白表达的改变以及家族性和获得性血栓性疾病有关，同时影响多种疾病，包括：疟疾、脓毒症、肿瘤、不良妊娠结局等的易感性[33-34]。目前报道的EPCR基因变异主要在内含子1位点C2532T，外显子3（6367位点）23bp嵌入，5’-UTR 1651C/G的多态性，内含子2 6333C/T的多态性[35-36]等。目前关于EPCR的分子缺陷都是个别散在的报道，还有待收集大规模的样本做进一步的探索，对EPCR基因型的进一步深入研究和对自身抗体的识别将有助于预估病患发生血栓性事件的发生率，继而实行个体化治疗。
