杨晓娜
【摘 要】本文综述了植物组织总RNA提取方法比较与难点对策分析。植物组织总RNA提取方法有化学试剂提取和试剂盒提取两种。化学试剂提取法有强变性剂法、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸法、LiCl-尿素法、阴离子去污剂法、皂土法、硅藻土-苯酚法。其中，除皂土法和硅藻土-苯酚法是近年提出的较新的植物组织总RNA提取方法外，其余的都被广泛应用。本文可为植物组织总RNA提取方法研究提供参考。
【关键词】植物组织;总RNA提取;方法
RNA是转录水平上研究基因表达与调控机制的载体，是基因操作的重要对象。它主要包括3种：rRNA占82%，tRNA占16%，mRNA占2%[1]。RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解，而且植物组织RNA的提取较动物和微生物困难，如酚类物质氧化后可使RNA 活性丧失[2]，多糖可形成难溶胶状物质与RNA一起被沉淀[3]，所以细胞内RNA分子的多样性和易被降解决定了其提取过程的复杂性。
所有RNA的提取过程都包括以下5个要点：即样品细胞或组织的彻底破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNase的有效抑制;充分地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离;对于多糖含量高的样品还需要将多糖杂质完全除去。其中最关键的是抑制RNase活性[4]。由于RNA的提取对分子生物学的研究至关重要，所以纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作例如：Northern杂交、mRNA纯化、互补DNA文库的构建及PT-PCR等提供了良好的保证[5]。
但是，有关植物总RNA提取方法与难点对策分析的总结迄今仍不完整。2005年谷守芹等讨论了植物组织总RNA提取的常用方法及检测技术[6]。2009年杨占军等简要介绍了几种植物组织总RNA的提取方法，总结了在提取过程中遇到的酚类物质、多糖和蛋白质的干扰及外源RNase污染等问题[7]。
本文较系统总结了近年有关植物组织总RNA提取的方法、适用范围及提取过程中出现的问题和具体的解决策略，以期为总RNA提取方法的比较研究提供参考。
1 植物组织总RNA提取的方法
1.1 化学试剂提取
1.1.1 强变性剂法
1968年，Cox首次运用胍盐从富含RNase的植物材料中抽提出无降解的RNA[8]。胍盐和异硫氰酸胍都是强的蛋白质变性剂，可以很快的抑制RNase而保证分离出完整的RNA[9]。其原理是高浓度的强变性剂盐胍和异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使得核酸和核蛋白分离，灭活RNase，当细胞裂解后，除RNA外，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，可通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、完整的总RNA[10]。该方法的优点在于有强烈的蛋白变性剂，能有效抑制植物材料及提取液中的RNase活性，可用于提取大量植物材料的RNA[7]。其缺点是有毒，价格偏高。适用于植物各类组织总RNA的提取。
1987年，CHOMCZYNSLI和LOGEMANN分别用异硫氰酸胍和盐胍从植物组织中提取RNA[11-12]。2009年，万群等用该法提取甘薯茎总RNA，所提取的RNA经过甲醛凝胶电泳和紫外线分光光度计分析，RNA的质量较高，基本没有降解[13]。
1.1.2 CTAB法
1992年CHANG，PURYEAR和CAIRNEY运用CTAB法从松树中分离出RNA[14]。该法的原理是较高浓度的CTAB不仅对植物细胞有较好的裂解作用，而且还能有效分离核蛋白与核酸的复合物，同时和巯基乙醇共同作用使蛋白变性、抑制RNase活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀总核酸，然后再选择性地分离出RNA[6]。2005年，程水源等采用CTAB法提取银杏叶的RNA，结果表明抽提的RNA经电泳检测，可见28 S rRNA 和18 S rRNA两条主带，反转录合成的cDNA经RAPD扩增，出现清晰的条带[15]。2008年，郑杨等运用CTAB法从中国樱桃花粉中快速提取RNA[16]。
1.1.3 热硼酸法[17]及改良热硼酸法[18]
该技术将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和氯化锂选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物、二硫苏糖醇作为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可与多酚化合物形成复合体，这几种物质都可抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合[19]。因此，该技术非常适合于富含酚类物质的植物组织中总RNA的提取。2004年，李继刚和郭三堆研究和探讨了一种可用于高质量棉花总RNA提取的热硼酸法，结果表明，该方法制备的RNA质量较高[20]。
1.1.4 LiCl-尿素法
用高浓度尿素抑制RNase并分离核蛋白与核酸，用LiCl选择性沉淀RNA。该方法操作简单，试剂价格低廉，但有时会存在DNA污染。2002年，赵双宜首次运用该法高质量提取小麦幼叶和不同法发育时期种子的RNA[21]。2005年，赵小兰等运用该法提取多花蔷薇扦插苗根、叶总的RNA[22]。
1.1.5 阴离子去污剂法
阴离子去污剂可以解离核酸与蛋白质的结合，并且蛋白质与带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀[23]。去污剂多用SDS，主要作用是分离核蛋白与核酸复合物，并与巯基乙醇、苯酚等共同抑制RNase的活性。2008年，杨成君等运用SDS法提取红果叶片的RNA，凝胶电泳显示28S条带是18S条带亮度两倍，而且无污染[24]。
1.1.6 皂土法
皂士具有吸附蛋白质及有效抑制RNAse的特性[25-27]。其原理是在提取缓冲液中加入皂土，减少了后期酚/氯仿抽提的次数，从而降低了RNA的损耗，缩短了实验时间，并且还能有效的抑制RNase。其特点是耗时少，提出的RNA样品纯度高，完整性好。2006年张容等以麻风树幼叶为材料，在提取缓冲液中加入皂土有效地去除了蛋白质并抑制RNAse，建立了一种高效的植物RNA提取方法[28]。
