丁顺杰，傅 裕，钟雨珅，丁晓雯*
（西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715）
酶法降解鸭肠中胆固醇对鸭肠品质的影响
丁顺杰，傅 裕，钟雨珅，丁晓雯*
（西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715）
摘 要：目的：研究酶法降解鸭肠中胆固醇对其品质的影响，为工业化生产低胆固醇鸭肠提供实验数据。方法：自制胆固醇氧化酶粗酶降解鸭肠中胆固醇；分光光度法测定胆固醇含量；质构剖面分析法（texture profile analysis，TPA）和色差分析法测定鸭肠质地及色泽变化。结果：经粗酶处理的鸭肠胆固醇含量为26.31 mg/g，降解率为25.81%；挥发性盐基总氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量为13.30 mg/100 g，pH 6.87，硬度为10 459.10 g，弹性为0.96，咀嚼性为6 816.36 g，鸭肠内、外壁亮度值分别为60.52、62.23。结论：自制胆固醇氧化酶粗酶可以有效降解鸭肠胆固醇，对其感官品质有一定的改善。
关键词：鸭肠；胆固醇氧化酶；胆固醇；感官品质
随着人们生活水平的提高，越来越多的特色菜品出现在火锅餐桌上，如鸭肠、鹅肠、猪脑花、毛肚、鱿鱼等，但它们大都含有较高的胆固醇，对人们的健康有一定的不利影响，高胆固醇是引起高血脂、冠心病、动脉硬化和心肌梗塞等病症的重要因素[1]。因此，减少和控制膳食中高胆固醇的摄入量对预防心脑血管疾病至关重要。
目前，降低食品中胆固醇方法可分为物理法、化学法和微生物法三大类，其中物理和化学方法都存在影响食品安全性、胆固醇降解率较低等缺陷[2]，而利用胆固醇氧化酶降解食品中的胆固醇作为一种安全高效的方式成为研究热点[3-7]，但该方法应用到工业化生产由于成本较高，导致实用性不够。本实验通过短杆菌（Brevibacterium sp.）产生含胆固醇氧化酶的粗酶液直接处理鸭肠，考察粗酶液对鸭肠胆固醇降解能力、鸭肠品质的影响，期望为工业化应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
新鲜鸭肠为麻鸭的小肠，购于重庆百货大楼北碚超市二店。
胆固醇标准品（纯度≥99%） 美国Sigma公司；无水乙醇（纯度≥95%）、石油醚（沸程：30～60 ℃）、冰乙酸（纯度≥99.5%）、硫酸铁铵等均为分析纯 成都科龙化工试剂厂。
1.2仪器与设备
TA.XT2i物性测定仪 英国Stable Micro Systems Ltd公司；SC-80C全自动色差计 北京康光仪器有限公司；B-260恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂；XW-80A旋涡混合器 上海精科实业有限公司；pHS-3C型酸度计成都方舟科技开发公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂。
1.3方法
1.3.1 粗酶液的制备和提取
根据本实验室前期研究结果，短杆菌产胆固醇氧化酶的最佳发酵条件为28 ℃，培养基pH 7.5，装液量60 mL/250 mL，接种量6%，发酵时间28 h，此时产酶量达1 397.80 U/L。将生产的粗酶液置于－20 ℃冰箱保存备用[8]。
1.3.2 酶法降解鸭肠胆固醇的工艺
鸭肠预处理：剔除新鲜鸭肠表面脂肪，用干纱布吸干水分，放入食品专用保鲜袋于4 ℃冰箱保存备用。
粗酶液配制：参照参考文献[9]提供的方法，测定自制粗酶液的酶活力，用pH 7.1的磷酸盐缓冲溶液将其稀释为0.12 U/L备用。
新鲜鸭肠酶解过程如下：
粗酶组：称取1.0 g新鲜鸭肠，根据本实验室前期研究得到的最佳工艺[8]（料液比1∶10（m/V），酶解pH 7.1，酶解时间3 h，酶解温度25 ℃，酶用量为0.12 U/g）加入粗酶液处理。酶解完毕后，取出鸭肠，用水多次冲洗（3～5 次）后测定其中胆固醇含量。
纯酶组：用纯胆固醇氧化酶按照本实验室前期研究得到的最佳工艺[8]（料液比1∶10（m/V），酶解pH 7.1，酶解时间3 h，酶解温度25 ℃，酶用量为0.12 U/g）代替自制粗酶液处理鸭肠，测定其中胆固醇含量。
空白组：测定新鲜鸭肠胆固醇含量。
1.3.3 鸭肠中胆固醇含量和胆固醇降解率的测定
参照参考文献[10-11]提供的方法，称量1 g鸭肠样品于25 mL具玻塞试管内，加入4 mL无水乙醇，0.5 mL质量分数50%氢氧化钾溶液，在65 ℃恒温水浴中皂化l h。皂化完毕后取出试管冷却。加入3 mL质量分数5%氯化钠溶液，10 mL石油醚，盖紧玻塞，振摇2 min，静置分层。取上层石油醚液2 mL于25 mL具玻塞试管内，在65 ℃水浴中将石油醚挥干，加入8 mL冰乙酸，4 mL铁矾显色液，混匀，放置30 min后在560 nm波长处比色，测定吸光度。分别配制0、12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0 μg/mL的胆固醇标准溶液，以吸光度为纵坐标，胆固醇质量浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=1.751 8x－0.020 5 （R2=0.999 5）。在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。同时做空白实验。胆固醇含量按照公式（1）计算，降解率按照公式（2）计算。
式中：ρ为由吸光度查胆固醇含量标准曲线得到的胆固醇质量浓度/（μg/mL)；V1为静置分层后石油醚的总体积/mL；V2为从石油醚层中吸取的体积/mL；m为样品质量/g；12为8 mL冰乙酸和4 mL铁矾显色液总体积/mL。
式中：C1为降解前鸭肠中胆固醇的含量/（mg/g）；C2为降解后鸭肠中胆固醇的含量/（mg/g）。
1.3.4 粗酶法处理鸭肠的扩大实验
短杆菌产酶的扩大生产：将250 mL的锥形发酵瓶换为1 000 mL的，其他条件不变，方法同1.3.1节。发酵结束后将发酵液在4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，所得上清液即为粗酶液，于4 ℃条件下保存备用。
粗酶法处理新鲜鸭肠的扩大实验：剔除新鲜鸭肠表面脂肪，用干纱布吸干表面水分，称取100 g、1 000 g新鲜鸭肠，参照1.3.2节中粗酶法进行酶解。实验结束后测定其胆固醇含量，计算降解率。
1.3.5挥发性盐基总氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量的测定[12-13]
分别称取一定量新鲜鸭肠分别参照1.3.2节粗酶法、纯酶法进行酶解，将酶法处理完毕后的新鲜鸭肠用蒸馏水多次冲洗（3～5 次）后，绞碎搅匀，称取约10.0 g置于锥形瓶中，加100 mL水，不时振摇，浸渍30 min后过滤，滤液置4 ℃冰箱备用。用未处理的新鲜鸭肠做空白对照。采用GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》进行蒸馏滴定，同时做试剂空白实验。
1.3.6 pH值的测定
采用GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》的方法[14]，分别称取一定量新鲜鸭肠分别参照1.3.2节粗酶法、纯酶法进行酶解，将酶法处理完毕后的新鲜鸭肠洗净，称取约5.0 g于锥形瓶中，加50 mL水，不时振摇，浸渍40 min后过滤，测定滤液的pH值，同时用未处理的新鲜鸭肠做空白实验[15]。
1.3.7 质构特性的测定
选取厚度一致、酶法处理的新鲜鸭肠洗净，用滤纸吸去表面水分，将鸭肠剪成1 cm×1 cm×1 mm的厚度均匀的薄片，取中间固定部位置于P/0.5探头下，进行测定后取平均值。同时用未处理的新鲜鸭肠做空白对照。参数设定[16-18]：测前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，两次压缩时间间隔1 s，压缩比例为80%，探头选择为P/0.5，测定参数包括硬度、弹性、咀嚼性。
1.3.8 内外壁色泽的测定
选取色泽一致、酶法处理的新鲜鸭肠洗净，用滤纸吸去表面水分，将鸭肠剪成1 cm×1 cm×1 mm的厚度的均匀薄片，然后分别置于不同编号的培养皿中待测其色差，同时用未处理的新鲜鸭肠做空白对照。
色泽[19-20]测定：采用全自动色差仪测定L*、a*、b*值。色差仪首先用标准板校对，色泽参数用L*、a*、b*系统测定。对肠体进行六点检测，取平均值。
1.3.9 感官评定
选取厚度色泽一致，酶法处理的新鲜鸭肠洗净，然后分别置于不同编号的培养皿中进行评定，同时用未处理的新鲜鸭肠做空白对照[21]。整个评定过程由10 个培训过的感官评定员进行评定，感官评定得分标准如表1所示。
表1 鸭肠感官鉴定评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of duck intestine
1.4数据处理
所有实验均进行3 次以上的重复，用Excel软件计算其平均值，采用DPS软件分析显着性。
2 结果与分析
2.1酶法降解鸭肠中的胆固醇含量
表2 酶解前后鸭肠中胆固醇含量变化Table 2 Change in cholesterol content in duck intestine before and after degradattiioonn
由表2可知，经过酶法处理后，鸭肠中胆固醇含量均极显着降低（P＜0.01），其中纯酶处理的胆固醇降解效果最好，胆固醇降解率达到37.18%，而粗酶处理为25.81%。尽管粗酶处理的降解率比纯酶处理低近11.37%，但从生产技术和成本上来讲，粗酶相对纯酶更有优势，且粗酶可重复利用，因此有必要进一步考察鸭肠经粗酶处理后其品质的变化。
2.2粗酶法降解鸭肠中胆固醇的扩大实验结果
根据以上研究结果，采用粗酶法来扩大处理新鲜鸭肠，将鸭肠的单次处理量逐级扩大到100、1 000 g，进一步验证粗酶法对鸭肠胆固醇的降解效果。
表3 粗酶液降解鸭肠中胆固醇的扩大实验结果Table 3 results of ssccale-up experiments for cholesterol content in duck intestine after degradation
由表3可知，扩大后用粗酶法处理100、1 000 g组新鲜鸭肠，鸭肠中胆固醇含量极显着降低（P＜0.01），其胆固醇降解率分别为26.58%、25.34%，与未扩大时的降解率25.81%相比，变化不显着（P＞0.05），说明此方法比较稳定，可进一步研究其在工业生产上的运用。
2.3酶解前后鸭肠TVBN值和pH值的变化
TVBN值作为评定肉品的新鲜度常规指标，其值越小肉品越新鲜；肉品肌糖原通过糖酵解而生成大量乳酸，三磷酸腺苷降解形成磷酸，随着乳酸和磷酸的不断积累使得肉品pH值降低；而随着肉品自身生化反应的继续进行乳酸会降解，使得肉品pH值上升，肉品pH值的变化对肉色、肉质、货架期等均有显着影响[22]，因此，TVBN值、pH值是衡量鸭肠品质的重要指标。
表4 酶解前后鸭肠TVBN值、pH值变化Table 4 Change in TVBN and pH in duck intestine befre and after degradation
由表4可知，与空白组相比，纯酶法与粗酶法处理后鸭肠的TVBN值均显着上升（P＜0.05），但变化幅度较小，不到1 mg/100 g。与空白组相比，纯酶法与粗酶法处理后鸭肠的pH值均显着下降（P＜0.05），变化幅度也较小，不到0.5。三者的TVBN值和pH值均符合DBS 50/002—2011《重庆火锅鸭（鹅）肠》[13]中规定的TVBN值≤15 mg/100 g、pH≤8。说明粗酶法处理新鲜鸭肠后其新鲜度仍然符合要求。
2.4酶解前后鸭肠质构特性的变化
硬度（hardness）是指使食品达到一定变形所需要的力，即食品保持形状的内部结合力；弹性（springiness）反映了样品受到外力作用时变形及去力后的恢复程度；咀嚼性（chewiness）是一项质地综合评价参数，它是肌肉硬度降低，肌肉细胞间凝聚力降低，肌肉弹性减小等综合作用的结果[23-24]。利用质构仪测得酶处理前后鸭肠的部分质构参数是判断鸭肠品质变化的重要指标。
表5 酶解前后鸭肠质构特性的变化Table 5 Textural cchanges of duck intestine before and after degradation
由表5可知，经酶法处理后的鸭肠与空白组相比，硬度、咀嚼性的变化均不显着（P＞0.05）；经纯酶法处理后的鸭肠与粗酶法相比，弹性没有显着性变化（P＞0.05），但两者与空白组鸭肠相比，弹性均显着升高（P＜0.05），可能是因为酶解过程中pH值下降，鸭肠中结缔组织软化，僵硬消失，肌肉变得柔软且富有弹性的结果[25]。通过粗酶法处理鸭肠与纯酶处理效果相似，都能在一定程度上改善鸭肠的质构品质。
2.5酶解前后鸭肠内外壁色差的变化
肠壁为4 层结构，即黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜，在内环肌层中有横向穿越的结缔组织间隔带分布，内含有丰富的小血管和神经组织。新鲜鸭肠往往呈现暗红色，主要取决于鸭肠中的肌红蛋白和血红蛋白含量[26-27]。由于鸭肠的内壁和外壁感官颜色有所差异，故将鸭肠按照内外壁分开测定其色泽的变化。
表6 酶解前后鸭肠内外壁色差的变化Table 6 Changes in color parameters of inner wall and outer wall of duck intestine before and after degradation
由表6可知，经过酶法处理后的鸭肠内、外壁的亮度（L*）值与空白组相比均显着增大（P＜0.05），但增加幅度不大；与未处理鸭肠内、外壁相比，其红度（a*）值和黄度（b*）值变化不显着（P＞0.05）；通过粗酶法处理后的鸭肠与纯酶法处理后的相比，鸭肠内、外壁的亮度值、红度值、黄度值均没有显着性的变化（P＞0.05），说明通过粗酶法处理鸭肠与纯酶法处理效果相似，都能在一定程度上改善鸭肠的色泽品质。
2.6鸭肠感官评分结果
表7 酶解前后鸭肠感官评分Table 7 Sensory analysis of duck intestine before and after degradation
对不同处理方式的鸭肠进行感官评分，结果如表7所示。与空白组相比，经纯酶法与粗酶法处理的新鲜鸭肠，质地方面更有弹性，色泽方面白色略增，气味方面腥味略淡；通过粗酶法处理后的鸭肠与纯酶法处理后的相比，鸭肠的质地、色泽、气味都没有显着性的变化（P＞0.05），说明通过粗酶法处理鸭肠与纯酶法处理效果相似，都能在一定程度上改善鸭肠的感官品质。
3 结 论
采用酶法处理新鲜鸭肠可以明显降低其中胆固醇含量（P＜0.05）；粗酶法处理新鲜鸭肠的扩大实验测得胆固醇降解率与未扩大阶段所得降解率相近（P＞0.05），说明此方法比较稳定，可进一步研究其在工业生产上的运用。
酶法处理后鸭肠的pH值显着下降，TVBN值显着上升，但均低于相关法规对鸭肠pH值、TVBN值的上限要求，因此粗酶处理后鸭肠的新鲜度仍然满足要求。
经酶法处理后鸭肠的硬度、咀嚼性以及内、外壁红度值和黄度值变化不显着（P＞0.05）；而鸭肠的弹性和内外壁亮度值显着增大（P＜0.05）；另外通过感官评价实验，经酶法处理后的鸭肠质地更有弹性，白色略增，腥味略淡，说明通过粗酶法处理鸭肠与纯酶法处理效果相似，都能在一定程度上改善鸭肠的感官品质。因此有必要对如何提高粗酶法处理鸭肠后胆固醇降解率作进一步研究。
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Effect of Enzymatic Degradation of Cholesterolon Duck Intestine Quality
DING Shunjie, FU Yu, ZHONG Yushen, DING Xiaowen*
(Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)
Abstract:Objective: To explore the effect of enzymatic degradation of cholesterol on duck intestine quality. Methods: Crude cholesterol oxidase was prepared in our laboratory and used to degrade cholesterol in duck intestine. Duck intestinal cholesterol was measured by a spectrophotometric method. Duck intestine was subjected to textural profile analysis (TPA) and color difference analysis. Results: After duck intestine was treated by cholesterol oxidase, its cholesterol content was reduced by 25.81% to 26.31 mg/g; TVBN was 13.30 mg/100 g, pH was 6.87, hardness was 10 459.10 g, elasticity was 0.96, chewiness was 6 816.36 g, and the brightness of inner wall and outer wall of duck intestine were 60.52 and 62.23, respectively. Conclusion: The cholesterol oxidase could effectively degrade duck intestinal cholesterol, thereby improving the quality of duck intestine.Key words: duck intestine; cholesterol oxidase; cholesterol; sensory quality
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）07-0143-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201507026
*通信作者：丁晓雯（1963—），女，教授，博士，研究方向为食品安全与功能食品。E-mail：xiaowend@sina.com
作者简介：丁顺杰（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：dsjfreedom1990@163.com
基金项目：重庆市科委火锅菜品现代物流关键技术研发与产业化示范项目（CSTC2008AB1019）
收稿日期：2014-06-12
