新型琼脂扩散法检测食品中天然防腐剂ε-聚赖氨酸含量

刘友华

新型琼脂扩散法检测食品中天然防腐剂ε-聚赖氨酸含量

刘友华

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

为分析食品中ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）含量，建立一种新型琼脂扩散法，并对分析条件进行优化，验证在检测食品中ε-PL含量时的有效性。结果表明，质量分数0.002%亚甲基蓝、0.75%琼脂、ε-PL溶液pH值为2.0、牛津杯加液量750 μL时检测结果最佳。本方法允许检测橙汁中ε-PL最低含量为2 mg/kg、糕点和猪肉火腿中最低为10 mg/kg。这种新型琼脂扩散法具有操作简便、使用成本低、专一性高等优点，可以广泛应用于ε-PL生产企业和食品工业。

ε-聚赖氨酸；检测；琼脂扩散法；亚甲基蓝；牛津杯；食品

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一种由链霉菌属的微生物以非核糖体合成方式积累的聚氨基酸，它由人体必需氨基酸赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基形成酰胺键连接而成[1-3]。由于ε-PL是聚阳离子物质，它能够通过静电作用吸附到微生物表面，破坏其细胞膜并进而影响微生物生长繁殖，因此它能够抑制包括革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌在内的多种微生物的生长繁殖[4-7]。此外，ε-PL具有很好的水溶性、热稳定性，并且无异味[8-9]。基于上述生物活性以及毒理实验证明的安全性[10-11]，ε-PL已经被允许作为食品防腐剂在日本、韩国、美国等多个国家添加使用，它在常见食品中的添加量为50～500 mg/kg[2]。现在国内有多家科研单位进行ε-PL开发，其中几家单位的ε-PL项目已成功完成中试。国家卫生计生委于2014年4月批准ε-PL为食品添加剂新品种，添加量在150～250 mg/kg范围之内。然而到目前为止，还鲜见国内外检测食品中ε-PL含量的相关文献报道，我国也尚未制定食品中ε-PL的检测标准。为便于国家食品安全部门监管ε-PL在食品中的使用和相关企业推广ε-PL作为防腐剂在食品工业中应用，急需建立食品中ε-PL的检测方法。

目前ε-PL的检测方法均为检测发酵液中的ε-PL而建立的，主要有比色法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-14]。但比色法并不适合检测食品中ε-PL含量，因为食品浊度通常很高，会影响比色测定。采用HPLC法来检测食品中ε-PL含量时，由于食品组分复杂，发现HPLC法不易将ε-PL和食品组分分开，从而影响检测的准确度，目前还在研究之中。琼脂扩散法是一种常用的定量方法，它的原理为：待测物质在平板上扩散时，能形成明显的扩散圈，扩散圈直径与待测物质含量对数值呈线性关系[15-17]。近来，在探索ε-PL生产菌株筛选方法的过程中，Nishikawa等[18]发现，由于ε-PL和碱性染料亚甲基蓝之间的静电作用，当ε-PL在含有亚甲基蓝的琼脂平板上扩散时，能形成清晰的扩散圈，并且ε-PL质量浓度的对数值与上述扩散圈直径之间有很好的线性关系。基于上述原理本实验建立一种新型琼脂扩散法，并且对此方法检测食品中ε-PL含量的适用性进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ε-PL标品Ⅰ（约40 个赖氨酸残基，由Kitasatospora sp. NY 2-11发酵合成，纯度98%）、ε-PL标品Ⅱ（约30个赖氨酸残基，纯度99%） 日本Chisso公司；Nisin浙江银象生物工程有限公司；亚甲基蓝 美国Sigma公司；橙汁 汇源集团有限公司；糕点 市购；猪肉火腿 雨润控股集团。

1.2 仪器与设备

牛津杯（内径（6.0±0.1） mm、外径（7.8±0.1） mm、高（10±0.1） mm） 上海江星仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL储备溶液的制备

精确称取1 g ε-PL，溶解到100 mL溶剂中，5 mol/L盐酸溶液调节pH 4.0或pH 2.0，作为储备液。使用时，此储备液用pH 4.0或pH 2.0溶剂进一步稀释到所需ε-PL质量浓度。储备液在4 ℃条件下可保存1 周。

1.3.2 琼脂扩散法

灭菌后，待含有质量分数0.002%亚甲基蓝的琼脂溶液冷却到45 ℃，取10 mL琼脂溶液以无菌操作的方式加到培养皿中（100 mm×15 mm），凝固后作为琼脂平板。在琼脂平板上等距离安放牛津杯。将240 μL样品溶液加入各个牛津杯内，然后将平板转移到培养箱，在30 ℃条件下进行扩散，实验重复4 次。待牛津杯内的溶液扩散完毕，取下牛津杯，水平和垂直测量扩散圈直径，并记录平均值。

以ε-PL质量浓度对数值为自变量，相应的扩散圈直径为因变量，按下式计算回归直线方程：

Y=a×lgX＋b

式中：X为ε-PL溶液质量浓度/（mg/L）；Y为扩散圈直径/mm；a为回归直线斜率；b为回归直线截距。

本检测方法的准确度（被测量的测得值与其真值间的一致程度）以回归直线的斜率判断。斜率越大扩散性越好，反之越差。精密度（在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值或测得值间的一致程度）用来验证在给定ε-PL质量浓度范围内回归方程的有效性，以回归方程的回归系数来判断。标准曲线与Y轴截距可反映测定的灵敏度。

1.3.3 待测食品的处理

将待测食物浸泡20 min，均质后调节pH值为2.0，70 ℃加热10 min，10 000 r/min离心10 min，然后收集上清液作为食物浸液进行ε-PL含量检测。

1.4 数据处理

以ε-PL质量浓度对数值为自变量，对应的扩散圈直径为因变量，进行线性回归，计算回归方程。通过单因素方差分析各参数（斜率、灵敏度、R2、回收率）的平均值和标准偏差，通过Turkey法进行对比分析，显着性水平为P=0.05。所有的数据分析均采用Origin Profession 8.0软件包进行。

2 结果与分析

2.1 评估琼脂扩散法分析ε-PL含量

为研究食品中其他物质对琼脂扩散法的影响，按表1制备各种物质溶液，以1.3.2节平板扩散法进行实验，结果如表1所示；为研究扩散圈与ε-PL含量之间的线性关系，以蒸馏水为溶剂，配制一系列pH 4.0的ε-PL标准溶液（50、100、200、400、600、1 000 mg/L），对照为pH 4.0的蒸馏水，也在同样条件下进行扩散。结果如图1所示。

表 1 常见的防腐剂、金属盐、糖类物质、蛋白类物质在亚甲基蓝琼脂平板上的扩散Table 1 Diffusion of common preservatives, metal salts, saccharides,and proteins on agar plate containing methylene blue mm

ε-PL是一种聚阳离子物质，而亚甲基蓝是一种阳离子染料，当ε-PL在含有亚甲基蓝的琼脂平板上扩散时，由于ε-PL和碱性染料之间的静电排斥作用，可观测到扩散圈。结果如表1所示，L-赖氨酸（ε-PL的单体）、常用食品防腐剂以及其他物质均不会形成扩散圈。而ε-PL标品Ⅰ和ε-PL标品Ⅱ均形成清晰的扩散圈，并且两者之间的扩散圈直径差异不显着（P＞0.05），说明ε-PL分子质量对扩散圈直径影响不明显。如无特殊说明，以下实验均采用ε-PL标品Ⅰ作为ε-PL样品。

如图1a所示，随着ε-PL质量浓度的增加，扩散圈直径逐渐增大，而对照没有扩散圈形成。在采用微生物琼脂扩散法检测Nisin过程中，Nisin在接种指示菌的平板上扩散时，会形成清晰的抑菌圈，并且Nisin质量浓度的对数值和抑菌圈直径之间有线性关系[16-17]。因此，对上述扩散圈直径和ε-PL质量浓度对数值进行线性回归分析，发现直线的回归系数达到0.996 8，说明两者之间有很好的线性关系（图1b）。

图 1 1 ε-PL在亚甲基蓝琼脂平板上的扩散作用Fig.1 Diffusion of ε-PL on agar plate containing methylene blue

2.2 琼脂扩散法分析条件的优化

分析食品中ε-PL需要较高的灵敏度，而初始的分析条件不能满足上述要求。参考微生物琼脂扩散法定量Nisin中的主要影响因素[15,17]，选择不同质量分数的亚甲基蓝、琼脂、琼脂厚度、ε-PL溶液的pH值、牛津杯加液量为影响因素，优化琼脂扩散法检测食品中ε-PL的分析条件。

2.2.1 亚甲基蓝质量分数对琼脂扩散法的影响

将一系列pH 4.0的ε-PL标准溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分别含有不同质量分数亚甲基蓝（0.001%、0.001 5%、0.002%、0.003%、0.004%）的平板上进行扩散。结果如表2所示。

表 2 亚甲基蓝质量分数对琼脂扩散法的影响Table 2 Effect of methylene blue concentration on agar diffusion assay

扩散前，含有质量分数0.001%以上亚甲基蓝的平板颜色均为蓝色。扩散后，质量分数0.001%和质量分数0.001 5%亚甲基蓝平板上形成不清晰的扩散圈（边缘模糊）。推测可能0.001%和0.001 5%亚甲基蓝平板含有的正电荷染料太少，不能完全抵抗ε-PL的静电排斥作用，一些亚甲基蓝分子移动较快，而一些亚甲基蓝分子移动较慢，因此导致扩散圈边缘不清晰。

不同亚甲基蓝质量分数对应的斜率之间并没有显着差异（P＞0.05），因此不同亚甲基蓝质量分数不会影响该方法的准确度。另一方面，发现随着亚甲基蓝质量分数的增加，灵敏度明显的下降。不同质量分数亚甲基蓝之间扩散时间的差异不大，均为16 h。因此，选择质量分数0.002%亚甲基蓝为琼脂扩散法检测发酵液和食品中ε-PL含量时的分析条件。

2.2.2 琼脂质量分数对琼脂扩散法的影响

将一系列pH 4.0的ε-PL标准溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分别含有不同质量分数的琼脂（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、2.00%）平板上进行扩散。结果如表3所示。

当琼脂质量分数不小于0.75%时，平板上均形成了清晰的扩散圈；而对于琼脂质量分数为0.50%的平板，此条件下由于部分琼脂发生液化，导致扩散圈不清晰。随着琼脂质量分数的增加，回归直线斜率（彼此差异显着，P＜0.05）逐渐下降（表3），因此降低琼脂质量分数会增加琼脂扩散法的准确性。而随着琼脂质量分数的减少，灵敏度逐渐增加；和2.00%琼脂相比，0.75%琼脂灵敏度增加了236.5%。除了质量分数0.75%琼脂的扩散时间为18 h，其他质量分数琼脂的扩散时间均为16 h。质量分数0.75%琼脂具有高的灵敏度和准确度，因此选择作为检测食品中ε-PL含量时的分析条件。

2.2.3 琼脂厚度对琼脂扩散法的影响

将一系列pH 4.0的ε-PL标准溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分别装有不同体积琼脂溶液（10、15、20、25、30 mL）的平板上进行扩散。结果如表4所示。

表 4 琼脂厚度对琼脂扩散法的影响Table 4 Effect of agar depth on agar diffusion assay

如表4所示，不同琼脂厚度对应回归直线斜率之间差异不显着（P＞0.05），因此琼脂厚度不会影响该方法的准确度。然而，随着琼脂厚度的减小，灵敏度显着增加。和20 mL琼脂溶液相比，10 mL琼脂溶液的灵敏度增加了206%。15～30 mL琼脂溶液的扩散时间均为16 h，而10 mL琼脂溶液的扩散时间略微延长，为18 h。10 mL琼脂溶液是能够形成琼脂平板的最小琼脂溶液体积，它具有高的灵敏度和准确度，因此选择作为检测食品中ε-PL含量时的分析条件。

2.2.4 ε-PL溶液pH值对琼脂扩散法的影响

配制pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.0、8.0的5 种ε-PL标准溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在平板上进行扩散。

ε-PL的等电点为9.0[19]，当ε-PL溶液pH低于9.0时，它会携带大量的正电荷，并且随着pH值降低，其所带正电荷的数量逐渐增加。因此ε-PL溶液的pH值会显着影响其在琼脂平板上形成的扩散圈大小。如表5所示，pH 4.0和pH 6.0的斜率之间没有显着差异；但是，和pH 4.0相比，pH 2.0、3.0、8.0的斜率显着下降（P＜0.05）。另一方面，随着pH值下降，灵敏度显着增加，特别是pH值从3.0降到2.0，灵敏度增加了94.5%。并且扩散时间均为16 h，回归直线的R2值均较高，说明pH值对琼脂扩散法的扩散时间和精密度影响不明显。ε-PL的pH值低于2.0时，易发生降解，综合考虑选择pH 2.0作为检测食品中ε-PL含量时的分析条件。

表 5 5 ε-PL溶液pH值对琼脂扩散法的影响Table 5 Effect off ε-PL solution pH on agar diffusion assay

2.2.5 牛津杯加液量对琼脂扩散法的影响

配制一系列pH 4.0的ε-PL标准溶液（50、100、200、300、400、600、800 mg/L），然后将250、500、750、1 000、1 250 μL ε-PL溶液分别在琼脂平板上扩散。由于牛津杯的最大加液量为250 μL，当加液量超过250 μL时，首先牛津杯中加入250 μL ε-PL溶液，扩散完后，再次加入250 μL，直到扩散完一定体积的ε-PL溶液。

表 6 牛津杯加液量对琼脂扩散法的影响Table 6 Effect off ε-PL solution volume added to Oxford cup on agar diffusion assay

如表6所示，各牛津杯加液量的斜率均显着不同（P＜0.05），随着牛津杯加液量增加，斜率显着上升，扩散时间逐渐延长，同时灵敏度显着增加（P＜0.05）。但随着牛津杯加液量增加，R2有所下降。一个可接受的回归直线，其R2应该不小于0.98，因此尽管1 000 μL和1 250 μL牛津杯加液量有较高的灵敏度，但并不适合作为检测条件。综合灵敏度和精密度考虑，选择750 μL作为检测食品中ε-PL含量时的分析条件。

2.2.6 琼脂扩散条件的验证

为验证上述优化的检测食品中ε-PL条件的有效性，将750 μL一系列pH 2.0的ε-PL标准溶液（2、3、5、10、15、20、25、35、50 mg/L）在琼脂平板（质量分数0.002%亚甲基蓝、0.75%琼脂、琼脂溶液量10 mL）上进行扩散。

图 2 2 ε-PL标准溶液在不同分析条件下的回归直线Fig.2 Regression lines for ε-PL standards diffused under initial assay conditions

图2 显示了在初始和优化分析条件下，ε-PL标准溶液相对应的回归直线。优化的检测食品中ε-PL条件的准确度比初始条件增加了4.3%，检出限从36.11 mg/L提升到1.64 mg/L。优化的检测食品中ε-PL条件的R2值为0.989 6，说明此条件下也具有较高的精密度。由以上数据推测，在上述优化的分析条件下，琼脂扩散法可以高灵敏度检测食品中ε-PL含量。

相比于Itazhaki比色法和HPLC法，目前琼脂扩散法具有简便、灵敏度高的优点。Itazhaki比色法检测时间虽短，但是检测结果重复性差，并且由于食品大多有一定的浊度，此方法不适合测定食品中的ε-PL含量。HPLC法虽然重复性好，检测迅速，由于ε-PL与蛋白质的性质相近，不易将其与蛋白类似物质完全分开；此外HPLC法使用成本较高，不适合多数企业用户的使用。

2.3 琼脂扩散法检测食品中ε-PL含量

为研究琼脂扩散法检测食品中ε-PL含量的有效性，选择了3 种食品进行实验。橙汁用来代表液体食物，糕点用来代表固体淀粉质食物，猪肉火腿用来代表固体蛋白类食物。

2.3.1 食品组分对ε-PL在琼脂平板上扩散的影响

称取5 g糕点或猪肉火腿加到20 mL蒸馏水中，经处理，收集上清液。分别以蒸馏水、橙汁、5倍稀释糕点浸液、5 倍稀释猪肉火腿浸液为溶剂，制备一系列ε-PL标准溶液（2、3、5、10、15、20、25 mg/L）。结果如图3所示。

图 3 不同溶剂制备的ε-PL标准溶液相应的回归直线Fig.3 Regression curves calculated from the diffusion of ε-PL standards on agar plates

以蒸馏水、橙汁、5 倍稀释糕点浸液、5 倍稀释猪肉火腿浸液为溶剂制备的ε-PL标准溶液相应回归直线的R2值分别为0.988 2、0.991 3、0.990 6和0.985 6，这说明在2～25 mg/L ε-PL质量浓度范围，以食物浸液为溶剂时，扩散圈直径和ε-PL质量浓度对数值之间也存在很好的线性关系。同时发现同样质量浓度的ε-PL溶液，当以食物浸液为溶剂时，其扩散圈直径小于蒸馏水为溶剂时的扩散圈直径，推测可能食品中组分会阻挡ε-PL在琼脂平板上扩散。因此，为补偿食品组分对琼脂扩散法的影响，应该以一定稀释倍数不含ε-PL的食物浸液为溶剂制备ε-PL标准溶液，食品样品稀释相同的倍数，扩散后，食物样品的ε-PL含量从ε-PL标准溶液相应的回归直线计算得出。这种条件下，可以最低检测橙汁中2 mg/kg ε-PL、糕点和猪肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

2.3.2 食品中ε-PL含量的评估

取50 mg ε-PL加入1 L橙汁中，混匀后调pH 2.0；以pH 2.0蒸馏水为稀释剂，将橙汁稀释5、10、20 倍；然后橙汁和稀释的橙汁溶液分别按上述步骤进行预处理；样品溶液在琼脂平板上扩散；最后样品ε-PL含量从以蒸馏水为溶剂制备的ε-PL标准溶液相对应回归直线计算得出。对于糕点和猪肉火腿，100 mg ε-PL直接和1 kg糕点或猪肉火腿均质，取5 g该食物，用pH 2.0蒸馏水分别稀释5、10、20、30、40、50 倍。其他分析步骤和2.3.1节相同。

当不能获得未添加ε-PL的食物时，若从以蒸馏水为溶剂制备的ε-PL标准溶液相应回归直线计算食物中ε-PL含量，会导致结果偏小。推测上层食品组分对ε-PL琼脂扩散的影响是由于食品成分高导致的，若适当稀释食物样品，可能能够减小食品组分对琼脂扩散分析的影响。对上述假设的有效性进行验证，结果如表7所示。

表 7 琼脂扩散法检测食品中ε--PPLL含量Table 7 Estimation off ε-PL in foods by agar diffusion assay mg/kg

由表7可知，随着稀释倍数的增加，食物中的ε-PL回收量逐渐上升，但当橙汁的稀释倍数高于5 倍、糕点的稀释倍数高于20 倍和猪肉火腿的稀释倍数高于30 倍时，ε-PL回收量变化不显着（P＞0.05）。橙汁和蛋糕的ε-PL最大回收率高于95%，而猪肉火腿的最大回收率略低，为91.77%。猪肉火腿中较低的ε-PL回收量可能是由蛋白类物质对ε-PL的强烈吸附作用造成的，在微生物琼脂扩散法定量高蛋白食品中Nisin（一种多肽类防腐剂）含量时也发现类似现象[20]。以上数据证明了上述假设的正确性，即食品中ε-PL含量也可以通过以下步骤检测：根据待检食物样品的特点，将样品稀释到适当的倍数，例如液体饮料稀释5 倍，淀粉质食品稀释20 倍，而蛋白类食物稀释到30 倍；预处理后，食物浸液在琼脂平板上扩散；最后从以蒸馏水为溶剂标准溶液相应的回归直线计算食物样品中ε-PL的含量。

3 结 论

琼脂扩散法分析食品中ε-PL的最佳分析条件为：质量分数0.002%亚甲基蓝、0.75%琼脂、ε-PL溶液pH值为2.0、牛津杯加液量750 μL。食品成分会影响ε-PL在琼脂平板上的扩散，但这种干扰作用能够通过稀释样品的方式消除。通过适当的制备ε-PL标准溶液或稀释样品溶液，这种新型琼脂扩散法能够可靠地定量检测橙汁中最低2 mg/kg ε-PL、糕点和猪肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

由于这种新型琼脂扩散法具有操作简便、使用成本低、专一性高等优点，因此可以用于ε-PL生产企业、食品工业以及其他ε-PL相关科学研究中ε-PL的检测。理论上，推测这种方法也可以用来检测其他聚阳离子物质，如聚精氨酸。此外，聚阴离子物质，如γ-聚谷氨酸（另一种微生物合成的另一种聚氨基酸），可能也可以用类似原理进行检测。因此，这种新型琼脂扩散法也为定性、定量其他聚阳离子和聚阴离子物质提供了一种新的研究思路。

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A Novel Agar Diffusion Assay for Qualitative and Quantitative Estimation of ε-Polylysine in Foods

LIU Youhua
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, Fuzhou 350002, China)

A novel agar diffusion assay was developed, optimized, and validated for the analysis of ε-polylysine (ε-PL) in foods. Re sults showed that the optimum assay conditions were 0.75% agar, 0.002% methylene blue, pH of ε-PL solution adjusted to 2.0 and 750 μL of ε-PL solution allowed to diffuse on agar plate. This method allowed detection of ε-PL at levels as low as 2 mg/kg in orange-juice, and 10 mg/kg in cake and pork ham. This proposed agar diffusion assay can be widely used in ε-PL-production and food industry because of its simplicity, cost-effectiveness, and high specificity.

ε-polylysine； determination； agar diffusion assay； methylene blue； Oxford cup； food

TS207.3

A

1002-6630（2015）08-0225-06

10.7506/spkx1002-6630-201508042

2014-08-26

福建省科技计划重点项目（2014Y0015）

刘友华（1963—），男，高级工程师，学士，研究方向为食品检测与发酵工程。E-mail：775729188@qq.com