何悦铭，王 杉，揭琴丰，邱伟华，黄晓婉，邓泽元，*
（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029）
手性色谱法测定L-乳酸锌
何悦铭1，王杉2，揭琴丰2，邱伟华2，黄晓婉1，邓泽元1，*
（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029）
研究高效液相色谱法测定乳酸锌中L-乳酸锌含量的方法，并对此方法学进行探讨。采用OA-5000手性色谱柱，1 mmol/L CuSO4·5H2O溶液为流动相，流速为1 mL/min进行色谱分离DL-乳酸锌，分离效果好。L-乳酸锌在0.147～3.675 mg/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数达0.99 9 9（n=6）；精密度 实验相对标准偏差为0.044%；稳定性实验相对标准偏差为0.061%；平均回收率达（99.8±1.90）%，相对标准偏差仅为1.90%。表明此方法操作简便，结果准确可靠，可用于L-乳酸锌的准确测定和品质监控。
高效液相色谱法；乳酸锌；手性
乳酸锌作为一种补充微量元素锌的新型营养强化剂，无臭、味甘甜，且价格适中；其相对于硫酸锌等补锌剂更易被人体吸收，对肠道无刺激［1-3］，具有增强食欲［4］、促进生长发育、提高肌体免疫力［5-6］和维持皮肤健康［7］等作用，可广泛用于食品、医疗保健等领域［8］。现代工业中乳酸锌主要是通过氧化锌与乳酸反应，硫酸锌与乳酸钙合成［9］而得。
合成乳酸锌的乳酸中含有一个手性碳原子，因此具有旋光性［10］。人体和动物体内存在的L-乳 酸脱氢酶只能代谢L-乳酸，不能分解吸收D-乳酸［11］。摄入过量的D-乳酸或DL-乳酸会致使血液中含较多D-乳酸，造成体 液中酸度过高，继而出现机体疲劳，代谢紊乱，甚至引起酸中毒等症状［12-13］；世界卫生组织明确规定人体每天摄取控制在100 mg/kg以下［14］。我国市场生产的乳酸主要是用发酵法［15-16］或化学合成法，大多是DL-乳酸制品。由此建立对乳酸锌及其制品准确测定L-乳酸锌的方法，对于控制品质、提高食品安全及监督水平具有重要的意义。
大多研究利用手性添加剂或衍生化反应对手性化合物进行拆分［17-20］，实验过程较为繁琐；因此近年已有许多研究利用手性固定相将对映体进行直接拆分［21-22］。Sumichiral OA-5000手性色谱柱是在反相模式中通过配位交换相互作用进行手性识别，其手性配位体是青霉胺涂敷在ODS硅胶表面，因此限制了添加到流动相的有机溶剂用量，而且流动相中必须包含Cu2+离子。从手性识别机理分析，氨基酸、羟基酸等待分离物与手性固定相、中心金属离子三者形成配位络合物（非对映体复合物），由于非对映体络合物相对稳定性不同而致使表现对映体分离的选择性［23］；因此该柱能有效地分离羟基酸的对映异构体，在应用于D-乳酸、L-乳酸异构体及其衍生物的分离中极为广泛。
目前尚无文献报道直接分离测定D-乳酸锌、L-乳酸锌的方法。本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，利用OA-5000手性色谱柱来分离D-乳酸锌和L-乳酸锌，用标准曲线法测定L-乳酸锌的光学纯度，希望建立一种快速简便、重复性好，结果准确可靠测定L-乳酸锌光学纯度的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳酸锌样品 高邮市申夏生物技术有限公司、南通飞宇生物科技有限公司、南通励成生物工程有限公司、上海申夏生物工程有限公司、郑州瑞普生物工程有限公司、江西武藏野生物化工有限公司；L-乳酸锌标准品（纯度≥98%） 成都艾科达化学试剂有限公司；五水硫酸铜（纯度≥99.5%） 日本和光纯药工业株式会社。
1.2 仪器与设备
自动进样1100 HPLC仪 美国Agilent公司；SUMICHIRAL OA-5000手性色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 日本住友化学株式会社；AL104电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3方法
1.3.1 色谱条件
SUMICHIRAL OA-5000手性色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相：0.6～1 mmol/L CuSO4·5H2O［20-21］；检测波长254 nm；流速0.7～1.0 mL/min；柱温20～40 ℃；进样量5 μL［24-25］。
1.3.2 定量与分离
精密称取样品0.250 g，置于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀。将配制好的溶液进行HPLC色谱分离，进样量为5 μL。
L-乳酸锌占总乳酸锌的质量分数w，按下式计算：
式中：AL为L-乳酸锌的色谱峰面积；AD为D-乳酸锌的色谱峰面积。
1.3.3L-乳酸锌标准曲线的绘制
精密称取0.375 g L-乳酸锌标准品，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容得到3.75 mg/mL储备溶液。精密量取储备溶液0.4、2、4、6、8、10 mL分别置于10 mL容量瓶中，加流动相定容，配制成0.15、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 mg/mL，经过滤膜（0.22 μm）后进样。以L-乳酸锌峰面积为纵坐标，标准品进样量为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.4 定量限与检测限
取质量浓度0.316 mg/mL标准品溶液，用流动相成比例稀释后进样。以RSN≥10时，测得此色谱条件下的定量限；RSN≥3时测得检测线。
1.3.5 精密度实验
取线性关系条件下2.5 mg/mL标准品溶液，重复进样6 次，以L-乳酸锌占总乳酸锌含量计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.6 稳定性实验
取线性关系条件下2.5 mg/mL标准品溶液和乳酸锌样品溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后进样测定，以L-乳酸锌占总乳酸锌含量计算RSD。
1.3.7回收率实验
配制乳酸锌样品溶液，分别加入高、中、低剂量的L-乳酸锌标准品。标准品加入量：1）低剂量为0.113 g（样品取样量的75%）；2）中剂量为0.150 g（样品取样量的100%）；3）高剂量为0.188 g（样品取样量的125%），每个梯度测定3 次，计算回收率。
1.4统计分析
2 结果与分析
2.1色谱条件的优化结果
初始色谱条件选用流动相CuSO4·5H2O浓度为0.60～1.0 mmol/L，流速为0.70～1.0 mL/min，柱温为20～40 ℃进行优化实验。通过紫外全波长扫描得到乳酸锌在波长254 nm处有最大吸收，且由于CuSO4·5H2O在低温条件下易发生结晶，优化后最终选用色谱条件为流动相为1 mmol/L CuSO4·5H2O，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，测定效果最好。
2.2L-乳酸锌标准曲线的绘制
以进样量（X）为横坐标，L-乳酸锌峰面积（Y）为纵坐标，绘制成标准曲线（图1）。L-乳酸锌标准曲线回归方程：Y=218.52X+19.054，R2为0.999 9，线性范围：0.147～3.675 mg/mL，在此范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。
图1 1L-乳酸锌标准曲线图Fig.1 Standard curve of L-zinc lactate
2.3专属性实验
取光学纯度大于96%的L-乳酸锌溶液进样并记录色谱图，确定分离度。D-乳酸锌、L-乳酸锌峰分离度为5.27（不小于1.5）；L-乳酸锌峰的理论塔板数为5 003（不小于5 000）。L-乳酸锌保留时间为20.846 min，D-乳酸锌保留时间为27.426 min。表明D-乳酸锌和L-乳酸锌分离效果良好（图2）。
图2 2D--乳酸锌、L-乳酸锌专属性高效液相图谱Fig.2 Typical HPLC chromatograms of D-zinc lactate and L-zinc lactate
2.4定量限与检测限
测定按比例稀释后溶液的信噪比。当RSN≥10时，测得L-乳酸锌定量限质量浓度为3.10×10－2mg/mL；当RSN≥3时，测得L-乳酸锌检测限质量浓度为1.23× 10－2mg/mL。
2.5精密度
按照1.3.5节配制3 组精密度测试溶液，每组进样6 次，以L-乳酸锌含量计算，得到RSD为0.044%（远小于5%），表明方法的精密度较高（表1）。
表1 1L-乳酸锌占总乳酸锌含量测定的精密度实验结果Table1 Precision of experimental data for the proportion of zinc L-lactate relative to total zinc lactate
2.6稳定性
按照1.3.6节配制3 组稳定性测试溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后进样测定，计算标准溶液L-乳酸锌峰面积RSD为0.061%（远小于5%），样品溶液L-乳酸锌峰面积RSD为0.074%；结果表明该方法测定L-乳酸锌有较好的稳定性（表2）。
表2 2L-乳酸锌测定的稳定性实验结果Table2 Results of stability tests
2.7回收率
按照1.3.7节配制回收率测试溶液，分别加入样品量75%、100%和125%的标准品，每个加入量进行3 组平行，计算得L-乳酸锌平均回收率为99.8%（在规定80%～120%之间），表明该法具有较高回收率（表3）。
表3 3L-乳酸锌回收率实验Table3 Results of spiked recovery tests
2.8样品L-乳酸锌含量测定
采用该色谱条件测定各样品L-乳酸锌含量。高邮市申夏生物技术有限公司生产的L-乳酸锌含量为（99.55±0.071）%，南通飞宇生物科技有限公司的L-乳酸锌含量为（99.49±0.014）%，南通励成生物工程有限公司的L-乳酸锌含量为（99.43±0.007）%，上海申夏生物工程有限公司的L-乳酸锌含量为（99.48±0.049）%，郑州瑞普生物工程有限公司的L-乳酸锌含量为（99.51±0.014）%，江西武藏野生物化工有限公司的L-乳酸锌含量为（49.11±0.17）%。
3 结 论
该色谱条件下测定L-乳酸锌和D-乳酸锌的分离度达5.27且L-乳酸锌有良好的专属性；L-乳酸锌检测限质量浓度为1.23×10－2mg/mL，定量限质量浓度为3.10×10－2mg/mL。在线性范围0.147～3.675 mg/mL内，相关系数为0.999 9；重复测试计算L-乳酸锌占总乳酸锌含量RSD为0.044%。标准测试溶液在放置72 h内测定，L-乳酸锌占总乳酸锌含量RSD仅为0.061%，而样品溶液中L-乳酸锌占总乳酸锌含量RSD为0.074%。平均回收率达到99.8%。结果表明该色谱法测定乳酸锌中L-乳酸锌含量检测限与定量限低，重复性和稳定性好，回收率高，可用于L-乳酸锌的准确测定和品质监控。
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Methodology Validation for Determination of L-Zinc Lactate by High Performance Liquid Chromatography with A Chiral Column
HE Yueming1， WANG Shan2， JIE Qinfeng2， QIU Weihua2， HUANG Xiaowan1， DENG Zeyuan1，*
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang Universit y， Nanchang 330047， China；2. Center for Disease Control and Prevention of Jiangxi Province， Nanchang 330029， China）
This paper describes the development of a validated method for determining L-zinc lactate by high performance liquid chromatography （HPLC）. An ideal chromatographic separation between D-zinc lactate and L-zinc lactate was achieved on an OA-5000 chiral column using 1 mmol/L CuSO4·5H2O as mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The established calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 0.147 to 3.675 mg/mL， with a correlation coefficient of 0.999 9 （n = 6）. The relative standard deviation （RSD） for precision and stability were respectively 0.044% was and 0.061%， and the average recovery was （99.8 ± 1.90）% with RSD of 1.90%. It is shown that this method is simple，accurate and reliable， and can be used to monitor the content of L-zinc lactate.
high performance liquid chromatography （HPLC）； L-zinc lactate； chirality
TS202.3
A
1002-6630（2015）14-0107-04
10.7506/spkx1002-6630-201514021
2014-11-16
2013年食品安全国家标准制定项目（spaq-2013-25）
何悦铭（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：he_yue_ming1992@163.com
邓泽元（1963—），男，教授，博士，研究方向为营养与功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn
