杨丽君，梁君妮，曹 鹏，关丽丽
（1.威海出入境检验检疫局，山东 威海 264200；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000）
鱼肉中氟苯尼考标准样品的制备
杨丽君1，梁君妮2，曹鹏2，关丽丽2
（1.威海出入境检验检疫局，山东 威海 264200；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000）
研究鲤鱼鱼肉基质中氟苯尼考的标准样品制备方法。通过添加氟苯尼考养殖鲤鱼获得样品基质，用液相色谱串联质谱法对样品的均匀性和稳定性进行检测，通过8 家实验室协作定值的方式对标准样品进行定值和不确定度评估，结果表明样品的均匀性良好，稳定性可达36 个月，可以用于水产品中氟苯尼考残留检测质量控制和相关的科研需要。
标准样品；氟苯尼考；均匀性；稳定性；不确定度
氟苯尼考是一种新型的酰胺醇类动物专用抗生素，具有抗菌谱广、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，被畜牧和水产养殖业广泛应用［1］。氟苯尼考在体内分布较广，半衰期长，具有胚胎毒性和耐药性，在动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。随着氟苯尼考在养殖中大量、不规范应用，它在畜禽、水产品等动物性食品中的残留问题也日益被重视［2］。我国农业部公告规定，氟苯尼考在水产品的肌肉和皮脂最高残留限量不得超过1 000 μg/kg；日本规定，氟苯尼考在鱼类中的残留限量不得超过200 μg/kg；美国食品药品监督管理局规定水产品中氟苯尼考的残留限量不得超过100 μg/kg。本研究从养殖到定值进行探讨，研制了性质稳定、可长期保存的氟苯尼考冻干基体标准样品。
目前氟苯尼考的检测方法有高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法等，在食品兽药残留检测过程中，通常采用加标回收实验作为质量控制的手段。但与实物标准样品相比，加标回收实验是一种模拟阳性样品，难以反映出真正阳性样品的提取效率，如欧盟明确要求动物源食品兽药残留检测必须采用基体标准样品进行过程质量控制。
虽然我国食品相关的标准样品不少，但目前标准样品主要集中于无机元素方面，含兽药残留标准样品的研究较少。本研究以鲤鱼为养殖对象，模拟用药得到天然污染的原料，经制备得到氟苯尼考实物标样，该样品均匀、稳定，有助于对氯霉素类的药品进行监测或作为实验室质控样品。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
实验用鲤鱼购于市场。
氟苯尼考标准物（纯度＞99.0%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、甲醇、正己烷（均为色谱纯） 德国Merk公司；乙酸、甲酸（均为色谱纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。
1.2仪器与设备
1290B型高效液相色谱、G6490A三重四极杆质谱仪美国Agilent公司；CF16RXⅡ型高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；Milli-Q超纯水制备机 美国Millipore公司；氮吹浓缩仪 美国Organomation Associates公司。
1.3方法
1.3.1标准样品的制备
由市场上直接购买活鲤鱼，从中随机取样，检测确认为阴性样品后进行饲养。在室温环境下养殖2 d 后，根据预先设定的药物含量，向鱼池中添加氟苯尼考，实时监控检测水体中和鱼体内的氟苯尼考含量，氟苯尼考在鱼体内的含量不断富集增高，当鱼肉中的氟苯尼考含量达到预设含量时，将鲤鱼捕捞至不含药物的池中继续养殖1 d 后捕捞。
将鲤鱼宰杀，洗去血水取肌肉部分，混合搅碎制成鱼糜，－70 ℃真空冷冻干燥。将冷冻干燥的鱼糜粉碎后研磨过筛，用聚乙烯瓶分装，加贴唯一性标识，常温保存，每个瓶内样品质量约4.0 g，共768 瓶。以备进一步做均匀性和稳定性检测［3］。
1.3.2样品前处理
依据GB/T 22959—2008《河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》，称取（1.00±0.01）g鱼粉样品，置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入4.0 mL纯水浸泡过夜。加入25 mL乙酸乙酯和0.75 mL氨水，超声波混合5 min，5 000 r/min离心5 min，移取上层乙酸乙酯至25.0 mL鸡心瓶中，向残渣中再加20 mL乙酸乙酯和0.60 mL氨水，振荡混合5 min，5 000 r/min离心5 min，合并上层乙酸乙酯相，40 ℃旋转浓缩至近干，氮气吹干。加入1 mL流动相（V（甲醇）∶V（水）=60∶40）定容，振荡混合30 s，加入2 mL正己烷，振荡1 min，除去上层正己烷，再加入2 mL正己烷，振荡1 min，取下层水相5 000 r/min离心5 min，溶液过滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3.3液相色谱及质谱条件
色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温：30 ℃；进样体积：2.0 μL；流动相A为水，流动相B为甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.1 min，10% B；0.1～4.0 min，10%～95% B；4.0～5.0 min，10% B；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测，电子倍增管电压：350 V；雾化气压力：20 psi；干燥气温度：200 ℃；干燥气流速：12 L/min；毛细管电压：3 000 V；定量离子对m/z 356/185；定性离子对m/z 356/336。
1.3.4均匀性检验
从制备的标准样品中随机抽取15 个独立包装，每个样品重复测试3 次，分析样品中氟苯尼考的含量。所有的样品以随机次序在重复性条件下测试，按照上述检测方法对样品进行均匀性检测，检测数据用单因素方差分析法来判断标准样品是否均匀［4］。
1.3.5稳定性检验
稳定性是标准样品研制的关键，本实验同时考察了鱼肉冻干粉氟苯尼考标准样品的短期稳定性和长期稳定性［5-8］。
标准样品稳定性研究的基本模型是Y=β0+β1X+ε，用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以x代表时间，y代表标准样品中氟苯尼考的含量，斜率b1用式（1）计算［17］：
截距b0用式（2）计算［17］：
与斜率相关的不确定度Sb1用式（3）计算［17］：
在95%的置信水平，t临界值用t0.95（n－2）表示，当|b1|＜t0.95（n－2）·Sb1，表明标准样品是稳定的。
1.3.5.1短期稳定性检验
短期稳定性实验进行30 d，按先密后疏选0、2、5、9、14、30 d 6 个时间点，随机取18 瓶放于（40±2） ℃保存，模拟运输中遇到的极端温度，每次测量随机选择3 瓶，平行测定2 次，进行样品的短期稳定性分析。
1.3.5.2长期稳定性检验
将样品的存放温度设定为（－20±2） ℃，长期稳定性实验时间为24 个月，选6 个时间点0、3、6、12、18、24 月，每次测量随机选择3 瓶，平行测定2 次，进行样品的长期稳定性分析。
1.3.6定值分析
参照CNAS—CL04：2007《标准物质标准样品生产者能力认可准则》［9］第二部分标准物质标准样品的定值-通用原则和统计原理，标准样品由多个实验室采用多种方法进行定值，本研究选择8 家氟苯尼考检测能力得到中国国家合格评定委员会认可的实验室进行协作定值，每个实验室发3 个样品，每个样品独立测定2 次，定值方法为实验室认可的检测方法［10-12］。
2 结果与分析
2.1样品谱图
按前述分析方法处理样品后，得到的选择离子监测色谱图（10 μg/kg）如图1所示。由图1可见，氟苯尼考的响应值良好，标准鱼肉样品中氟苯尼考的残留量是适当的。
图1 鱼肉中氟苯尼考的总离子图Fig.1 Total iron chromatograms of florfenicol in fish
2.2均匀性检测结果
标准样品的特性应当均匀，即在规定的细分范围内保证其特性不变。在均匀性检验过程中，一般需同时考察组间均匀性及组内均匀性［13-16］，用方差分析法通过对两者的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。均匀性检验结果如表1、2所示。
表1 氟本尼考标准样品均匀性检验（n=3）Table1 Homogeneity test of florfenicol reference material （n= 3）
表2 氟本尼考样品均匀性检验的单因素方差分析结果Table2 Results of one-way analysis of variance for florfenicol homogeneityneity
根据方差分析原理，该统计量是自由度为（v1，v2）的F分布变量。由公式v1=m－1，v2=N－m，并已知m=15，N=3×15=45；则v1=14，v2=30，F=1.672＜F0.05（14，30）=2.037，故该样品组内及组间无显着性差异，样品均匀性良好，能满足实验要求。
2.3稳定性检测结果
2.3.1短期稳定性
表3 氟本尼考标准样品短期稳定性检验（n=6）Table3 Short-term stability test of florfenicol reference material （ n= 6）
表3是6 个时间点测得的氟苯尼考含量的数据及平均值，线性拟合模型分析结果见表4，从表4可以看出，表明氟苯尼考在（40±2）℃极端运输条件下30 d内无明显的降解趋势，未观测到不稳定性。
表4 氟本尼考标准样品短期稳定性数据分析结果Table4 Linear model for short-term stability of florfenicol reference material
2.3.2长期稳定性
表5是6 个时间点测得的氟苯尼考含量的数据及平均值，线性拟合模型分析结果见表6，通过分析可得出故斜率是不显着的，表明氟苯尼考在（－20±2）℃条件下24 个月内未观测到不稳定性。
表5 氟本尼考标准样品长期稳定性检验数据Table5 Long-term stability test of florfenicol reference material
表6 氟本尼考样品长期稳定性数据的分析结果Table6 Linear model for long-term stability of florfenicol reference material
从实验结果可以看出，鱼肉冻干粉氟苯尼考标准样品的短期稳定性和长期稳定性都很良好，完全符合标准样品的要求。
2.4定值
8 个认可实验室均采用液相色谱-串联质谱法检测，参加协同定值数据及处理结果见表7。
表7 各定值实验室的氟苯尼考测定数据（n=6）Table7 Analytical data for florfenicol obtained by different accredited laboratories （n= 6）
将每个实验室的数据 先用Grubb's法进行检验，无异常值；汇总各实验室数据，将所有的数据按大小顺序排列，进行夏皮罗-威克尔检验，公式见式（4）［17］
经计算W=0.959，当n=48时，P=0.947，W＞P，表明在显着性水平α=0.05上符合正态分布。再将每个实验室的平均值组成一组数据，用Grubb's法进行双侧情形检验，确定各实验室数据无异常值；将所有数据进行下一步统计，用Cochran检验以确定8 个实验室中没有随机误差太大的实验室，公式见式（5）［17］：
式中：si为各实验室测定结果的标准偏差；smax为si中的最大值。
显着性水平α=0.05，测定组数为8，每组测定6 次，计算C值，与Cochran检验临界值C0.05（8，6）比较，经检验，C=0.278 8，C0.05（8，6）=0.36，C＜C0.05（8，6），表明各实验室间的测量属于等精度测量，汇总所有数据，计算总平均值为氟苯尼考标准样品含量定值结果：10.17 μg/kg。
2.5不确定度评估
本标准样品的不确定度来源主要有以下几个方面［18-23］：标准样品的不均匀性引入的不确定度，标准样品的不稳定性引入的不确定度以及标准样品定值过程中引入的不确定度。考虑到氟苯尼考标准样品在室温条件下有较好的稳定性，该保存条件在运输中比较容易实现，因此在合成不确定度中可以不考虑短期稳定性不确定度分量。
由标准样品不均匀性引入的不确定度，见表2，当组间均方MSamong＞组内均方MSwithin，不均匀性不确定度［17］ubb=Sbb。
由标准样品不稳定性引入的不确定度，设长期稳定性保质期t为24 个月，则由长期不稳定性带来的不确定度贡献为：ults=Sb·t=0.009 65×24=0.231 6 μg/kg。
由定值引入的标准样品不确定度［17］为：
经计算，uchar=0.134 5 μg/kg。
标准样品的合成不确定度［17］公式为：
经计算，氟苯尼考标准样品的各项不确定度如表8所示。
表8 氟苯尼考标准样品的不确定度Table8 Uncertainty of florfenicol reference material
设置信水平为P=99%，包含因子k=3，则标准物质的定值结果为（10.17±0.93）μg/kg。
3 结 论
通过添加氟苯尼考养殖鲤鱼获得样品基质，制备的样品与日常检测样品相一致，在均匀性和稳定性均满足标准样品要求的前提下，通过8 家实验室协作定值的方式对标准样品进行定值和不确定度评估，定值结果通过有证标准物质溯源，同时制备的标准样品稳定性可达到36 个月，满足水产品中氟苯尼考残留检测质量控制和相关的科研需要。本研究样品制备方式和标准样品定值方法的建立，对其他兽药残留标准样品的制备具有参考意义，对于建立食品兽药残留干粉标准样品的国家标准具有重要意义。
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Preparation of Reference Material for the Determination of Florfenicol in Fish
YANG Lijun1， LIANG Junni2， CAO Peng2， GUAN Lili2
（1. Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weihai 264200， China；2. Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yantai 264000， China）
A method for preparing florfenicol reference material （RM） from the muscle of common carp fish exposed to aqueous florfenicol when alive was investigated. The homogeneity and stability of the prepared sample were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The certified value for florfenicol was based on analysis of results obtained in 8 accredited laboratories and uncertainty evaluation was conducted. The results showed that the reference material had a good homogeneity and stability within 36 months， and could be used for the determination of florfenicol residue in aquatic products.
reference material； florfenicol； homogeneity； stability； uncertainty
O657
A
1002-6630（2015）14-0176-05
10.7506/spkx1002-6630-201514034
2014-09-11
“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK08B01）；质检公益性行业科研专项（201310143）；国家质检总局科技计划项目（2013IK178）
杨丽君（1969—），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品检测。E-mail：18663136117@163.com
