李成龙，葛平珍，周才琼,*（.西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 40075；.贵州省轻工业科学研究所，贵州 贵阳 55000）
不同淀粉原料制备鲊海椒发酵过程中抗氧化活性
李成龙1，葛平珍2，周才琼1,*
（1.西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；2.贵州省轻工业科学研究所，贵州 贵阳 550002）
摘 要：以粳米、玉米、芋头-玉米作为淀粉原料制备鲊海椒，测定不同淀粉原料制备的鲊海椒中总还原力、氧自由基吸收能力以及总多酚、总黄酮、VC、VE、总酸含量等抗氧化指标随发酵时间的变化，并通过对总还原力、氧自由基吸收能力及总多酚、总黄酮、VC、VE、总酸含量等指标做主成分分析以确定最大抗氧化活性的最佳发酵时间。结果表明：3 种淀粉原料制备的鲊海椒均在发酵30 d时具有最高的综合评分，且明显高于其他发酵时间鲊海椒的综合评分，总多酚及总酸含量贡献最为显着。对不同淀粉原料发酵30 d的鲊海椒进一步分析得出，粳米鲊海椒抗氧化能力要好于其他两种淀粉原料制备的鲊海椒。
关键词：鲊海椒；发酵；化学抗氧化作用；主成分分析
引文格式：
李成龙,葛平珍,周才琼.不同淀粉原料制备鲊海椒发酵过程中抗氧化活性[J].食品科学,2016,37(5):50-55.
LI Chenglong,GE Pingzhen,ZHOU Caiqiong.Antioxidant activity of Zhahaijiao made with different starches,a Chinese traditional fermented chili product,during fermentation[J].Food Science,2016,37(5):50-55.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605010.http://www.spkx.net.cn
鲊海椒是我国西南地区传统特色发酵辣椒制品，是以新鲜红辣椒与玉米、粳米或芋头等淀粉源以一定比例混合并添加适量盐后，在自然条件下厌氧发酵而成的地方特色美食。辣椒的营养价值高，可以增强食欲且具有多种保健功能，如防止动脉粥样硬化，治疗肌肉疼痛、关节炎等[1-3]，辣椒含较多抗氧化成分，包括多酚类、胡萝卜素类、VC和VE等[4-5]，也有报道显示鲊海椒配料芋头、玉米具有一定抗氧化作用[6-7]。鲊海椒在发酵过程中由于微生物的生长繁殖，乳酸等具有抗氧化作用的有机酸增加，结合型多酚释放等，会带来其抗氧化作用的改变，其中的乳酸菌不仅可以产生乳酸，还能够增强特异性与非特异性免疫[8-10]。目前对于不同淀粉原料制备的鲊海椒研究比较少，邵伟等[11-12]对玉米鲊海椒的发酵工艺进行了改进，王微等[13-14]建立了玉米鲊海椒的质量评价体系。本研究采用西南地区鲊海椒发酵常用原料玉米、芋头和粳米作为淀粉原料，粉碎或切丝后加入碎的鲜辣椒中并加入适量盐进行自然乳酸发酵，比较研究其发酵过程中化学抗氧化活性，以确定抗氧化活性最强的鲊海椒发酵时间及淀粉原料种类，引导人们食用发酵时间适宜的鲊海椒，并为鲊海椒的功能性质开发提供基础研究数据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
二荆条辣椒、芋头 重庆市北碚区天生农贸市场；加碘食盐、玉米、粳米 重庆市北碚区永辉超市。辣椒洗后沥干，粉碎；粳米、玉米用粉碎机粉碎后分别过40 目筛。3 种鲊海椒原料配比如下：辣椒-粳米面（粳米鲊海椒）、辣椒-玉米面（玉米鲊海椒）、辣椒-混合料（玉米面和芋头丝各一半）（混合鲊海椒）的质量比均为1∶1，盐添加量5%。将各种原料按配比混合均匀后装入罐中，罐口以水密封，20～30 ℃发酵，取不同发酵时间鲊海椒作为实验材料。
水溶性VE（Trolox） 美国Sigma-Aldrich公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2,2’-zobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH） 瑞士Adamas Reagent公司；铁氰化钾、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯化铁（FeCl3）等均为分析纯 成都市科龙化工试剂厂。
1.2仪器与设备
HH-6电热恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；FA2004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；722型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；TDL80-2B离心机 上海安亭科学仪器厂；Synergy H1 MG多功能酶标 美国基因公司。
1.3方法
1.3.1不同发酵时间鲊海椒样液的制备
参考王希春[15]的方法：分别取3 种10 g发酵0、15、30、45、60、90 d鲊海椒，采用50%乙醇提取。提取条件：料液比1∶8（m/V），浸提温度50 ℃，水浴2 h。冷却后过滤，将滤液3 000 r/min离心30 min得到上清液，并用提取溶剂定容至100 mL，即为样品提取液。置4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2不同淀粉源鲊海椒抗氧化能力测定
总还原力测定：参照Zhang Qingfeng等[16]所采用普鲁士蓝法：向离心管中加入1 mL各样液，再向其中加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）及2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混匀，于50 ℃水浴20 min。取出离心管，向其中加入2.5 mL 10% TCA终止反应，3 000 r/min离心10 min。移取2.5 mL上清液放入试管中，依次加入0.5 mL 3%的FeCl3溶液及2.5 mL蒸馏水。混匀后静置10 min，700 nm波长处测定吸光度。以1 mL提取溶剂（水、50%乙醇或无水乙醇）代替鲊海椒提取液作为空白对照，重复测定3 次，取平均值。分别取1 mL 100～500 μmol/L的Trolox溶液按以上步骤进行操作制备标准曲线，用磷酸盐缓冲液代替Trolox溶液作为空白对照，得到回归方程为y＝0.000 9x－0.001 2（R2＝0.990 9）。以下式计算各鲊海椒提取液的总还原力，总还原力以μmol TE/g表示。
式中：c为与1 mL样品抗氧化能力相当的Trolox标准品的浓度/（μmol/L）；V为样品总体积/L；m为取样量/g。
氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）测定采用Kim等[17]建立的方法：以0.5 mmol/L的Trolox溶液作为母液，分别配制0、10、20、30、40、50 μmol/L 6 个不同浓度的Trolox溶液，从而制作标准曲线（以Trolox溶液浓度作为横坐标，以各衰减曲线下面积作为纵坐标）。各样液稀释到合适浓度后进行实验。依次向96 孔板中加入25 μL 样品液、空白（pH 7.4的75 mmol/L磷酸盐缓冲溶液或相应的提取溶剂）或标准Trolox溶液，150 μL 81.63 nmol/L荧光素，置于37 ℃预热的酶标仪中，温育20 min后取出，迅速加入25 μL 153 mmol/L的AAPH溶液，将酶标板放入荧光酶标仪中进行扫描，于485 nm波长处激发、525 nm波长处发射，60 min内每隔1 min测定一次。以反应时间与荧光强度分别为横、纵坐标作荧光衰减曲线，计算曲线与横坐标之间的曲线下面积（area under curve，AUC）。
式中：f0为起始荧光强度，即t＝0 min时的荧光强度；fi为t＝i min时的荧光强度（荧光强度≤15 000时可认为反应结束）。
再以下式计算相对ORAC值：
1.3.3 鲊海椒中抗氧化功能活性成分测定
鲊海椒中总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu 法[18-19]，以每100 g鲊海椒中所含没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示，即总多酚含量的单位为mg GAE/100 g（以湿质量计，下同）。
鲊海椒中总黄酮含量的测定采用三氯化铝比色法[19]，以mg芦丁/100 g表示。
鲊海椒中VC含量的测定采用2,6-二氯酚靛酚法[20]；VE含量的测定采用紫外分光光度法[21]；总酸（以乳酸计）含量的测定采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱中和滴定法[22]。
1.4数据分析
2 结果与分析
2.1不同淀粉原料制备鲊海椒的总还原力及ORAC值随发酵时间的变化
传统发酵食品鲊海椒在发酵过程中受微生物厌氧发酵的影响，主要抗氧化成分含量会发生不同程度的改变。因此，通过总还原力及ORAC值可评价鲊海椒在发酵过程中抗氧化能力的变化。
2.1.1不同淀粉原料制备鲊海椒的总还原力
图1 不同淀粉原料制备的鲊海椒总还原力的变化Fig.1 Changes in reducing powder of Zhahaijiao prepared with different starches
抗氧化成分的还原力与其抗氧化性有显着相关性[23]，因此可将总还原力作为衡量待测物潜在总抗氧化能力的重要指标之一。鲊海椒在不同发酵时间总还原力的变化如图1所示，在整个发酵阶段，3 种淀粉原料制备的鲊海椒总还原力呈先增加后略降低的趋势，除0 d粳米鲊海椒与玉米鲊海椒、15 d玉米鲊海椒与混合鲊海椒的总还原力差异不明显外，在其他发酵时间3 种不同淀粉原料制备的鲊海椒总还原力均有明显差异。发酵15～30 d粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒总还原力均较高，分别为发酵0 d时的162.1%～152.3%、122.2%～116.3%和129.2%～126.6%；随发酵的进行，鲊海椒的总还原力呈降低趋势，至发酵90 d时，3 种鲊海椒的总还原力分别为发酵0 d时的146.10%、92.55%和112.63%。在本实验所选取的发酵时间内，以粳米淀粉原料制备的鲊海椒总还原力最高。
2.1.2不同淀粉原料制备鲊海椒的ORAC值
图2 不同淀粉原料制备的鲊海椒ORACC值的变化Fig.2 Changes in ORAC of Zhahaijiao prepared with different starches
ORAC值又称抗氧化能力指数，是评价总抗氧化能力的重要指标[24-25]。3 种鲊海椒在不同发酵时间的ORAC值变化如图2所示，在整个发酵阶段，3 种淀粉原料制备的鲊海椒ORAC值均随发酵时间延长呈逐渐增加后略降低的趋势，不同发酵时间各淀粉原料制备的鲊海椒ORAC值均有明显差异。粳米鲊海椒和玉米鲊海椒的ORAC值均在发酵60 d最高，分别为发酵0 d时的288.47% 和171.59%。而混合鲊海椒的ORAC值则在发酵30 d时最高，为发酵0 d时的139.98%。3 种鲊海椒发酵至90 d时，其ORAC值分别为发酵0 d时的233.18%、163.96%和107.34%。该结果显示，粳米鲊海椒在本实验所选取的发酵时间内具有较高的ORAC值，与2.1.1节总还原力测定结果基本一致。
2.2不同淀粉原料制备鲊海椒发酵过程中抗氧化营养素水平的变化
2.2.1不同淀粉原料制备鲊海椒的总多酚及总黄酮含量在发酵过程中的变化
图3 不同淀粉原料制备的鲊海椒总多酚含量变化Fig.3 Changes in total polyphenol content of Zhahaijiao prepared with different starches
不同淀粉原料制备的鲊海椒发酵过程中总多酚及总黄酮含量的变化如图3、4所示，3 种鲊海椒总多酚、总黄酮含量峰值出现在发酵30～45 d，此时粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒总多酚含量分别为发酵0 d时的165.7%～158.3%、167.1%～160.6%和126.3%～125.3%；总黄酮含量分别为发酵0 d时的137.7%～138.9%、128.9%～166.7%和143.4%～150.2%。在30～45 d内，以粳米鲊海椒和玉米鲊海椒总多酚含量较高，而总黄酮含量相对较低。
图4 不同淀粉原料制备的鲊海椒总黄酮含量变化Fig.4 Changes in total flavonoids content of Zhahaijiao prepared with different starches
2.2.2不同淀粉原料制备鲊海椒的维生素含量在发酵过程中的变化
图5 不同淀粉原料制备的鲊海椒VCC含量变化Fig.5 Changes in VC content of Zhahaijiao prepared with different starches
图6 不同淀粉原料制备的鲊海椒VE含量的变化Fig.6 Changes in VE content of Zhahaijiao prepared with different starches
如图5所示，3 种鲊海椒中VC含量均随发酵时间延长持续下降，发酵30～90d时，粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒中的VC含量分别仅为发酵0d时的48.8%～13.3%、24.9%～13.4%和28.8%～13.7%，在本实验所选取的发酵时间内，粳米鲊海椒中的VC保留状况总体好于玉米鲊海椒和混合鲊海椒。3种鲊海椒中VE含量则在发酵15～45 d内相对较高（图6），峰值出现在发酵30d，此时粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒中的VE含量分别为发酵0d时的3.17、2.11、3.09 倍，依然以粳米鲊海椒的VE含量相对较高。
2.2.3不同淀粉原料制备鲊海椒的总有机酸含量在发酵过程中的变化
图7 不同淀粉原料制备的鲊海椒总酸含量的变化Fig.7 Changes in lactic acid content of Zhahaijiao prepared with different starches
3 种鲊海椒中总酸（以乳酸计）随发酵时间的变化如图7所示，随发酵时间的延长，总酸含量快速上升，至发酵30 d后趋于稳定，发酵30～90 d时，粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒中的总酸含量分别为发酵0 d时的3.06～3.13、3.49～3.74、4.14～4.36 倍，以上结果表明不同的淀粉原料会影响发酵中总酸的形成，以芋头-玉米混合淀粉原料制备的鲊海椒总酸含量增幅较高。
2.3不同淀粉原料制备鲊海椒抗氧化作用及抗氧化成分主成分分析
对不同发酵时间3 种淀粉原料制备鲊海椒抗氧化活性及抗氧化成分进行主成分分析，结果见表1。
表1 不同淀粉原料制备鲊海椒的抗氧化活性及抗氧化成分主成分特征值及方差贡献率Table 1 Eigenvalues of principal components and their variance contributions for antioxidant activities and components of Zhahaijiao prepared with different starches
对粳米鲊海椒主成分载荷矩阵及特征向量分析见表2。由表1、2可知，粳米鲊海椒的第1、2、3主成分累计贡献率达97.384%，可解释原有7 个变量的绝大部分信息，第1主成分（PC1）贡献率占总变异信息的65.157%，主要反映总多酚及总酸含量的变异信息；第2主成分（PC2）贡献率占变异信息的17.667%，主要反映总黄酮含量的变异信息。第3主成分（PC3）的贡献率占变异信息的14.561%，主要反映VC及VE含量的变异信息。前3 个主成分累计贡献率达97.384%，建立前3 个主成分PC1、PC2、PC3的线性回归方程如下：
表2 粳米鲊海椒抗氧化活性及抗氧化成分主成分载荷矩阵及特征向量Table 2 Loading matrix and eigenvectors of principal components for antioxidant activities and components of Zhahaijiao prepared with japonica rice
将第1、2、3主成分方差贡献率作为权重系数建立对不同发酵时间粳米抗氧化能力综合评价模型，计算不同发酵时间粳米鲊海椒抗氧化能力综合得分，结果见表3，综合得分最高的为发酵30 d的粳米鲊海椒，其次为发酵45 d的粳米鲊海椒。
表3 不同发酵时间粳米鲊海椒抗氧化能力综合得分及排名Table 3 Comprehensive scores and ranking for antioxidant capacity of Zhahaijiao prepared with japonica rice at different fermentation times
对玉米鲊海椒主成分载荷矩阵及特征向量分析见表4。由表1、4可知，玉米鲊海椒的第1、2、3主成分累计贡献率达98.141%，可解释原有7 个变量的绝大部分信息，PC1贡献率占总变异信息的52.636%，主要反映总酸、总多酚、VE含量的变异信息，PC2贡献率占变异的30.535%，主要反映总还原力变异信息。PC3贡献率占变异信息的14.970%，主要反映总黄酮含量的变异信息，但成负相关。建立前3 个主成分PC1、PC2、PC3的线性回归方程：
表4 玉米鲊海椒抗氧化活性及抗氧化成分主成分载荷矩阵及特征向量Table 4 Loading matrix and eigenvectors of principal components for antioxidant activities and components of Zhahaijiao prepared with corn flour
将第1、2、3主成分方差贡献率作为权重系数建立对不同发酵时间玉米鲊海椒抗氧化能力的综合评价模型，计算不同发酵时间玉米鲊海椒抗氧化能力综合得分，结果见表5，发酵30 d的玉米鲊海椒抗氧化活性综合评分最高，发酵15 d的玉米鲊海椒次之。
表5 不同发酵时间玉米鲊海椒的抗氧化能力总得分及排名Table 5 Comprehensive scores and ranking for antioxidant capacity of Zhahaijiao prepared with corn flour at different fermentation times
表6 混合海椒抗氧化活性及抗氧化成分主成分载荷矩阵及特征向量Table 6 Loading matrix and eigenvectors of principal components for Zhahaijiao prepared with taro-corn flour
对混合鲊海椒主成分载荷矩阵及特征向量分析见表6。由表1、6可知，混合鲊海椒的第1、2主成分累计贡献率达80.678%，基本可解释原有7 个变量的大部分信息，PC1贡献率占总变异信息的60.176%，主要反映总酸、VE、总多酚含量的变异信息，PC2贡献率占变异的20.502%，主要反映总还原力的变异信息。建立主成分PC1、PC2的线性回归方程如下：
将第1、2的方差贡献率作为权重系数建立对不同发酵时间混合鲊海椒抗氧化能力的综合评价模型，计算不同发酵时间混合鲊海椒抗氧化能力综合得分，结果见表7，其中发酵30 d的混合鲊海椒抗氧化活性综合评分最高，发酵45 d的混合鲊海椒次之。
表7 不同发酵时间混合鲊海椒的抗氧化能力总得分Table 7 Comprehensive scores and ranking for antioxidant capacity of Zhahaijiao prepared with taro-corn flour at different fermentation times
3 结 论
总还原力分析显示，粳米鲊海椒在发酵过程中总还原力及其增幅均较高，总还原力峰值均出现在发酵15～30 d；ORAC值分析显示，粳米鲊海椒和玉米鲊海椒均在发酵60 d时ORAC值最高，但粳米鲊海椒的ORAC值增幅远高于玉米鲊海椒；而混合鲊海椒则在发酵30 d时ORAC值最高，增幅不及前两者；在发酵实验结束时，以粳米鲊海椒的ORAC值最高，表明不同淀粉原料会影响鲊海椒产品ORAC值大小及ORAC峰值出现时间。主要抗氧化成分分析显示，粳米鲊海椒、玉米鲊海椒和混合鲊海椒总多酚、总黄酮含量峰值出现在发酵30～45 d，以粳米鲊海椒和玉米鲊海椒总多酚含量较高，而总黄酮含量相对较低。3 种鲊海椒的VE水平在发酵15～45 d相对高，粳米鲊海椒VE含量高于玉米鲊海椒和混合鲊海椒。3 种鲊海椒的VC水平随发酵时间延长持续下降，粳米鲊海椒中VC保留状况总体好于玉米鲊海椒和混合鲊海椒。
经对不同发酵时间3 种鲊海椒中主要抗氧化指标含量变化及对抗氧化作用的影响进 行主成分分析发现，不同淀粉原料制备的鲊海椒均在发酵30 d时具有最高的综合评分。对发酵30 d的3 种鲊海椒进一步分析得出，粳米鲊海椒抗氧化能力要好于其他两种淀粉原料制备的鲊海椒。本实验结果表明，传统发酵食品鲊海椒在经过适当发酵后可以提升其抗氧化能力，抗氧化活性最佳的发酵时间约为30 d。
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Antioxidant Activity of Zhahaijiao Made with Different Starches,a Chinese Traditional Fermented Chili Product,during Fermentation
LI Chenglong1,GE Pingzhen2,ZHOU Caiqiong1,*
(1.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Guizhou Institute of Light Industry,Guiyang 550002,China)
Abstract:Japonica rice,corn and a blend of taro and corn were used as starch sources to prepare Zhahaijiao,a Chinese traditional fermented chili product,and changes in reducing powder,oxygen radical absorbance capacity(ORAC),and the contents of total polyphenols,total flavonoids,VC,VE and lactic acid were measured during the fermentation process.These antioxidant parameters were further analyzed by principal comment analysis(PCA)to obtain the optimal fermentation time when Zhahaijiao had the highest antioxidant capacity.The results showed that Zhahaijiao prepared with all investigated starches had the highest comprehensive score when fermentation time was 30 days,which was much higher than those at other fermentation times investigated.PCA analysis suggested that total polyphenols and lactic acid were the dominant contributors.Through further analysis,antioxidant capacity of Zhahaijiao made with japonica rice was better than that from two other starches.
Key words:Zhahaijiao; fermentation; chemical antioxidant capacity; principal component analysis
中图分类号：TS251.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）05-0050-06
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605010 10.7506/spkx1002-6630-201605010.http://www.spkx.net.cn
*通信作者：周才琼（1964—），女，教授，博士，研究方向为食品营养化学。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn
作者简介：李成龙（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：654196032@qq.com
基金项目：重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目（cstc2014pt-gc8001）
收稿日期：2015-05-08
