汲聪玲,陆剑锋,吕 顺,姜绍通,林 琳*

(合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽 合肥 230009)

不同提取温度对白鲢鱼皮明胶理化性质的影响

汲聪玲,陆剑锋,吕 顺,姜绍通,林 琳*

(合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽 合肥 230009)

本实验以白鲢鱼皮为原料提取鱼皮明胶,考察不同提取温度(30、50、70、90、100 ℃)对鱼皮明胶得率和理化性质的影响。结果表明:不同温度条件下提取的鱼皮明胶的紫外吸收峰均在波长218 nm左右;明胶提取率在提取温度为90 ℃时最大,为(86.91±0.98)%;50 ℃条件下提取的鱼皮明胶的凝胶强度最大,为(896.75±117.03)g;聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,30、50 ℃条件下提取的鱼皮明胶由α1、α2、β 3 条肽链组成,70、90、100 ℃条件下提取的鱼皮明胶由于明胶分子的热降解,电泳条带不明显;30、50、70、90、100 ℃条件下提取的鱼皮明胶的热变性温度分别为(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37)℃;提取温度越高,明胶的G''和G'值越小、流变性能越差。

提取温度;明胶;产率;凝胶强度;流变特性

明胶是由动物结缔组织中的胶原蛋白大分子在一定的条件下引起氢键或静电性键断裂,胶原的三股螺旋结构解体,互相缠绕的链松开后得到的产物[1]。胶原蛋白转变为明胶的过程包含两部分:一是热变性过程,即胶原蛋白受热导致氢键或静电性键断裂,螺旋结构解链形成许多无规则水溶性线团;二是交联的水解过程,即在酸、碱、酶的作用下,胶原蛋白分子中的交联键部分断裂,形成明胶分子,此过程受提取温度、pH值等条件的影响[2]。

鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)是我国四大淡水鱼之一,产量位居淡水养殖鱼类的第二位。鱼皮中含有丰富的蛋白质,其中胶原蛋白含量占粗蛋白的 80%左右[3]。利用鱼皮作为生产明胶的原材料不仅可以节约资源、减少环境污染,还可以避免哺乳动物明胶潜在的安全隐患及宗教限制。鱼皮明胶的黏度和分子质量很接近哺乳动物明胶;但是鱼皮明胶的亚氨酸含量低于哺乳动物明胶,导致鱼皮明胶的热变性温度低于哺乳动物明胶,这使得鱼皮明胶的在市场上应用有一定的限制[4-5]。

明胶生产工艺有酸法(A型)、碱法(B型)、酸碱法,还有极少数采用酶法[6]。由于鱼类明胶的等电点与哺乳动物明胶不同,鱼类明胶适合用酸法生产。明胶提取过程中,温度是一个重要的参数,温度过低,提取效率低,而温度过高又会影响明胶的特性。Kaewruang等[7]研究表明65 ℃或75 ℃对单角革鲀(Aluterus monoceros)皮明胶的提取效果较好。本实验以白鲢鱼皮为原料,研究提取温度对明胶的紫外吸收、得率(gelatin recovery,GR)、凝胶强度(gel strength,GS)、分子质量、热变性温度、流变特性等性质的影响,为鲢鱼皮明胶的生产提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活鲢鱼购于合肥周谷堆农产品批发市场,平均质量(1.0±0.5) kg。鲜活鲢鱼宰杀后,将鱼皮与鱼肉剥离,鱼皮去鳞、去黏连碎肉后,冲洗干净,用滤纸吸干水分,将沥干的鱼皮剪成小片(5 mm×5 mm),放入保鲜袋中于-20 ℃冻藏备用。

异丙醇 天津市富宇精细化工有限公司;对甲氨基苯甲醛 上海埃彼化学试剂有限公司;高氯酸天津市鑫源化工有限公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白质标准品 美国Bio-Rad公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV22102 PC型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;CT15RT 台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司;DISICOVERY HR-3 流变仪美国TA公司;DYY-11 型电泳仪 北京市六一仪器厂;90-3型双向定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂有限公司;FD-1A型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;VP-DSC微量差示扫描量热仪 上海和晟仪器科技有限公司;Texture Analyzer物性测试仪美国FTC公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼皮预处理

脱脂:将鱼皮样品解冻,水洗干净后,用体积分数20%异丙醇4 ℃萃取24 h,去除脂肪类物质。

去杂蛋白:将脱脂后的鱼皮加入质量分数5% NaCl溶液(1∶20,m/V),于4 ℃条件下连续搅拌24 h,用尼龙纱过滤,用蒸馏水(1∶20,m/V)水洗样品并过滤,重复3 次,去除鱼皮中的非胶原蛋白。

1.3.2 鱼皮明胶的提取工艺流程

预处理的鲢鱼皮→盐酸(0.2 mol/L)溶液浸泡45 min→水洗至pH 4~5→ 50 ℃水浴抽提5 h→纱布过滤→离心(10 000 r/min,5 min)→冷冻干燥→成品明胶(水分含量<14%)

1.3.3 鱼皮明胶理化性质的测定

1.3.3.1 明胶得率的计算

以鱼皮及明胶中羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量计算明胶得率。采用Woessner法[8]测定HYP含量:称取2 mg左右待测样品于安瓿管中,加入1 mL 6 mol/L的HCl,真空封管,在 130 ℃条件下水解3 h。消化后将消化液稀释定容至100 mL。取2 mL稀释液,加入1 mL氯胺T反应20 min,加入1 mL 37%的高氯酸反应5 min,加入1 mL 20%对甲氨基苯甲醛60 ℃反应20 min,冷却5 min。1 h内在557 nm波长处测吸光度。根据羟脯氨酸标准曲线计算样品中HYP的含量。按下式计算明胶得率(gelatin recovery,GR)。

1.3.3.2 紫外吸收光谱扫描

鱼皮明胶的紫外吸收光谱扫描参考陈小雷[9]的方法并作适当修改。取适量冷冻干燥的明胶样品,配制成质量浓度为0.1~0.5 mg/mL的明胶溶液,以蒸馏水作参比。在190~400 nm波长范围内用双光束紫外分光光度计对明胶溶液进行紫外扫描,分辨率为0.5 nm。

1.3.3.3 凝胶强度(gel strength,GS)的测定

配制质量分数6.67%的明胶溶液,60 ℃水浴使明胶溶解,取出在7 ℃条件下放置成熟16~18 h,用物性测定仪进行测定,测定条件参数为:NO-P/0.5探头,下压高度为4 mm,下压速率1 mm/s。探头下压到4 mm时,凝胶对探头的反作用力(g)达到最大值,这个最大反作用力即为测定的凝胶强度(g)。每组样品测4 个平行。

1.3.3.4 SDS-PAGE分析方法

参考陈小雷[9]的方法,采用8%分离胶和5%浓缩胶,溴酚蓝标记,上样量为10 μL。样品质量浓度为5 mg/mL,与SDS缓冲液按照1∶4(m/V)混合,使明胶最终质量浓度为1 mg/mL。采用直流恒流电源,电压100 V,电流50 mA,电泳时间约1.5 h,至样品中的染料迁移至离下端3~5 cm时停止电泳。电泳结束后,用考马斯亮蓝R-250染色20 min,脱色液浸泡过夜,使用凝胶成像系统对脱色的凝胶进行紫外透射拍照。

1.3.3.5 热变性温度的测定

鱼皮明胶热变性温度的测定参考陈小雷[9]的方法并作适当改变。取冷冻干燥的明胶样品5~8 mg,用坩埚密封后放入微量差示扫描量热仪中,加热温度20~130 ℃,升温速率为10 ℃/min。每个样品测定3 次。

1.3.3.6 鱼皮明胶的流变学特性分析

频率扫描参考Dileep等[10]的方法,配制质量分数为6.67%的明胶溶液,在20 ℃条件下,剪切频率从0.01~10 Hz,观察黏性模量(G″)、弹性模量(G')和损耗角正切(tanδ)随剪切频率变化的流变学曲线。

温度扫描参考Chandra等[11]的方法并作适当修改,配制质量分数为6.67%的明胶溶液,剪切频率为1 Hz,扫描温度5 ℃→45 ℃→5 ℃,观察黏性模量、弹性模量随温度变化的流变学曲线。

2 结果与分析

2.1 提取温度对鱼皮明胶得率的影响

明胶得率是明胶制备过程中的一个重要指标,选择合适的提取温度对明胶提取非常重要。不同提取温度对白鲢鱼皮明胶提取得率的影响如图1所示。提取温度对GR有显着影响(P<0.05),GR随提取温度的升高先增大后减小,在30~90 ℃范围内,提取温度升高GR增大,在90 ℃时达到最大值(86.91±0.98)%,当提取温度高于90 ℃时,继续升高温度,GR减小。

胶原蛋白溶液受热转变成一种胶状溶液,在合适浓度和温度等条件下可以发生胶凝反应,这就是明胶的生产过程[12]。胶原蛋白溶液受热转变成明胶的过程伴随着分子内及分子间交联键的断裂[13]。随着温度升高,作用力增大,胶原分子内及分子间的化学键断裂的更多、更彻底,使得明胶分子更容易从皮肤组织中游离出来,溶解到水溶液中,但当温度过高时,热力作用会导致明胶分子进一步断裂为更小的分子[13],因而使GR降低。

2.2 不同提取温度对鱼皮明胶的紫外吸收光谱的影响

不同提取温度对白鲢鱼皮明胶溶液的紫外吸收光谱的影响如图2所示。不同提取温度下提取的明胶溶液的紫外吸收光谱与陈小雷[9]、Chandra[11]等的结果类似。明胶溶液的紫外吸收峰都在218 nm左右,证明明胶肽链分子中存在酰胺键[11]。大多数蛋白质中存在一些芳香族氨基酸残基,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,所以这些蛋白质溶液在波长270~280 nm处存在紫外吸收峰。但是明胶分子中一般不包含这些芳香族氨基酸残基,所以在波长270~280 nm处没有紫外吸收峰[14],如图2所示。提取温度对明胶溶液的紫外吸收光谱影响很小,几种明胶的紫外吸收峰的波长位置非常接近,只是峰值大小有微小差别。

2.3 提取温度对鱼皮明胶凝胶强度的影响

GS是代表明胶品质的重要指标之一,GS的大小不仅与原料种类[4]、提取工艺条件有关[15],还与明胶的亚氨基酸、羟脯氨酸含量有关[13]。研究表明,鱼明胶的GS一般在0~426 g,牛、猪明胶的GS在200~300 g,而温水提取的鱼明胶的GS会更高一些[16]。

不同提取温度对白鲢鱼皮明胶GS的影响如图3所示。方差分析结果表明,提取温度对明胶的GS有显着影响(P<0.05)。由图3可知,GS随提取温度升高先增大后减小,在50 ℃时GS达到最大值(896.75±117.03) g。当提取温度大于50 ℃时,鱼皮明胶的GS呈下降趋势。明胶分子与水分子在60 ℃水浴中发生分子内交联,温度降低后,明胶溶液形成具有一定网状结构的胶凝体。明胶分子链越长,网状结构越坚固,相应的胶凝体的凝胶强度更大[7]。提取温度在50 ℃以下时,明胶分子链较长,明胶溶液形成的胶凝体内部分子之间的连接力较大,GS较高;提取温度高于50 ℃时,明胶分子随提取温度升高发生降解,分子链较短,明胶溶液形成的凝胶体内部作用力变小,导致凝胶强度降低。

2.4 提取温度对鱼皮明胶分子质量和肽链组成的影响

由图4可知,明胶分子包含α1、α2、β这3 条链,分子质量在130~250 kD之间;当提取温度为30、50 ℃时,明胶分子的结构保持比较完整,特别是50 ℃条件下提取的鱼皮明胶,与明胶标准品肽链组成非常相似。随着提取温度的升高,明胶分子断裂为更小的片段,分子质量降低[13]。从图中可以看出,在70、90、100 ℃条件下提取的明胶的α1、α2、β这3 条链受热降解,分子质量变小,没有明显的电泳条带。因此,提取温度对明胶的分子质量和肽链组成有较大影响。

2.5 提取温度对鱼皮明胶的热变性温度的影响

不同提取温度条件下所提取的鱼皮明胶的微量差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry,DSC)扫描曲线如图5所示。30、50、70、90、100 ℃条件下所提取的明胶的热变性温度分别为(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37) ℃。明胶的热变性温度就是明胶的玻璃转化温度[9]。在加热过程的DSC曲线中的吸热峰所在的温度点即为明胶的热变性温度,它表示明胶分子的结构由螺旋向卷曲转变[17]。明胶分子的交联作用越少,其变性温度越低[18]。明胶的热变性温度由明胶的亚氨基酸的含量来决定,亚氨基酸的含量越高,明胶的三级结构稳定性就越强,主要是因为脯氨酸和羟脯氨酸的吡咯环对它们的三级结构的限制和羟脯氨酸的羧基所形成的氢键来稳定它们的三级结构[19]。从图中可以看出,50 ℃条件下所提取的鱼皮明胶的热变性温度最高,提取温度高于50 ℃时,随着提取温度的提高,鱼皮明胶的热变性温度逐渐降低。这可能是因为温度高于50 ℃时,随着提取温度提高,明胶分子发生了热降解作用,从而使明胶溶液内部分子交联作用小,导致热变性温度降低。30 ℃条件下所提取的明胶的热变性温度最低,这可能是由于提取温度较低,鱼皮中的明胶没有被充分提取,最终产品的纯度较低,导致其热变性温度较低。从SDS-PAGE图谱上也可以看出30 ℃条件下所提取的明胶纯度较低,α链和β链均不明显。

2.6 提取温度对鱼皮明胶的流变学性能的影响

2.6.1 鱼皮明胶的频率扫描曲线

不同提取温度下得到的鱼皮明胶的弹性模量(G')、黏性模量(G″)和损耗角正切(tanδ)与剪切频率的关系如图6所示。随着剪切频率的增大,不同提取温度下所提取的鱼皮明胶的G'增大,G'的斜率减小。G'斜率变化越小,说明凝胶网络的内部交联越强,凝胶稳定性越好[10]。G″和tanδ均随着剪切频率增大呈现先降后升的趋势。tanδ值都在1附近,说明几种明胶均呈现部分黏性和弹性的流变学性质[20]。从图6还可以看出,不同提取温度下提取的鱼皮明胶的G'、G″及tanδ随剪切频率的变化趋势是相同的。30、50、70 ℃条件下提取的鱼皮明胶的G'、G″和tanδ的数值大小非常接近,90 ℃和100 ℃条件下提取的鱼皮明胶的G'和G″的数值比之前3 组明胶的小很多,而tanδ的数值大很多。提取温度升高使明胶分子质量减小,导致凝胶网络的内部交联变少,明胶溶液内部贮藏的能量变小。

2.6.2 鱼皮明胶的温度扫描曲线

不同提取温度条件下鱼皮明胶的黏性模量和弹性模量在加热和冷却过程中的变化如图7所示。G'是指在明胶溶液的弹性结构中储存的能量,G″表示明胶溶液黏性部分的能量[21]。从图中可以看出,不同提取温度对鱼皮明胶的G'、G″随温度的变化趋势是相同的。G'和G″在加热过程中均是降低的,在冷却过程中均是升高的。溶液温度在10 ℃以下时G'的值大于G″,此时明胶溶液以弹性为主;溶液温度较高时明胶溶液以黏性为主,此结果与陈小雷[9]、Norziah[17]等的研究结果相似。

从图7还可以看出,提取温度为90、100 ℃时,温度扫描曲线中G'和G″的斜率比提取温度为30、50、70 ℃时小。这是因为在胶原蛋白受热转化成明胶的过程中,连接胶原蛋白肽链的化学键和部分肽键发生断裂[22],提取温度提高,会导致明胶分子的水解,而明胶的水解程度越高,明胶的肽链越短[18]。提取温度升高导致明胶分子的降解,分子内部储能减少,溶液在加热或冷却过程中内部储存的能量差减小,G'和G″变化缓慢,因此斜率较小。

3 结 论

本研究比较了不同提取温度对鲢鱼鱼皮明胶的得率和理化性质的影响。结果表明,提取温度对鱼皮明胶溶液的紫外吸收影响很小,但是对GR和GS影响显着(P<0.05)。提取温度为90 ℃时GR取得最大值为(86.91±0.98)%,而GS在50 ℃时取得最大值(896.75±117.03) g。SDS-PAGE图谱显示当提取温度在30、50 ℃时,所提取的鱼皮明胶的结构较完整,由α1、α2、β 3 条肽链组成,分子质量在130~250 kD之间;当提取温度高于50 ℃时,明胶分子开始降解成小分子组分,电泳条带较模糊。不同提取温度(30、50、70、90、100 ℃)下所提取的鱼皮明胶的热变性温度分别为(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37)℃。提取温度通过影响明胶的分子质量大小和肽链组成从而影响明胶溶液内部储藏能量的大小,继而对明胶溶液流变性能产生一定的影响。本研究结果可为鲢鱼皮的高值化利用和鱼皮明胶的生产提供参考。

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Effect of Extraction Temperature on Physical and Chemical Properties of Gelatin from Silver Carp Skin

JI Congling, LU Jianfeng, LÜ Shun, JIANG Shaotong, LIN Lin*
(Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, College of Food Science and Engineering,Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Gelatin was extracted from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) skin, and the physical and chemical characteristics of gelatin extracted at different temperatures (30, 50, 70, 90 and 100 ℃) were compared. The maximum ultraviolet absorption peaks of all gelatin appeared near 218 nm. The maximum gelatin recovery ((86.91 ± 0.98) %) was obtained when extraction was performed at 90 ℃, while the maximum gel strength ((896.75 ± 117.03) g) was obtained when the extraction temperature was 50 ℃. The SDS-PAGE pattern indicated that gelatin extracted at 30 and 50 ℃ contained α1, α2and β chains, while that extracted at 70, 90 and 100 ℃ did not have obvious bands, which was presumably ascribed to heat degradation of gelatin. The thermal denaturation temperatures of the gelatin extracted at 30, 50, 70, 90 and 100 ℃were (97.88 ± 2.65), (108.66 ± 0.43), (106.48 ± 3.33), (100.27 ± 2.37) and (99.56 ± 0.37) ℃, respectively. The higher the extraction temperature was, the smaller the values of G' and G'' were, and the worse rheological properties of gelatin were.

extraction temperature; gelatin; recovery; gel strength; rheological properties

10.7506/spkx1002-6630-201609022

TS254.9

A

1002-6630(2016)09-0117-06

汲聪玲, 陆剑锋, 吕顺, 等. 不同提取温度对白鲢鱼皮明胶理化性质的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(9): 117-122. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609022. http://www.spkx.net.cn

JI Congling, LU Jianfeng, LÜ Shun, et al. Effect of extraction temperature on physical and chemical properties of gelatin from silver carp skin[J]. Food Science, 2016, 37(9): 117-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609022. http://www.spkx.net.cn

2015-05-22

安徽省“115”产业创新团队项目(2012d5t146)

汲聪玲(1988—),女,硕士研究生,研究方向为食品资源综合利用。E-mail:2865611490@qq.com

*通信作者:林琳(1978—),女,副教授,博士,研究方向为水产品加工副产物综合利用。E-mail:linlin@hfut.edu.cn