陈 露，陈季旺，2，*，蔡 俊，丁文平，2，吴永宁，3（.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023；3.国家食品安全风险评估中心，北京 0002）
大米镉结合蛋白的分离纯化及纯度鉴定
陈 露1，陈季旺1，2，*，蔡 俊1，丁文平1，2，吴永宁1，3
（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023；3.国家食品安全风险评估中心，北京 100021）
摘 要：采用石墨炉原子吸收光谱法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）测定不同品种、不同加工精度大米及大米4 种蛋白质中的镉含量。选用镉含量较高的大米为实验原料，采用Osborne分级法提取大米中的4 种蛋白质（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白），以及超滤、离子交换色谱从镉含量较高的大米蛋白中分离纯化出均一纯度的大米镉结合蛋白（rice Cd-binding protein，RCBP），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鉴定RCBP的纯度及测定分子质量。结果表明：籼米中镉含量高于糯米及粳米；随着加工精度的增加，同种大米中的镉含量依次降低。4 种大米蛋白中的镉含量分别为0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中镉含量最高。超滤分离大米清蛋白（rice albumin，RA）得到大米超滤清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA），离子交换色谱纯化RUA得到目标镉结合蛋白（组分c），SDS-PAGE鉴定组分c为单一条带，分子质量为14 kD。
关键词：大米镉结合蛋白；分离纯化；离子交换色谱；分子质量
引文格式：
陈露， 陈季旺， 蔡俊， 等.大米镉结合蛋白的分离纯化及纯度鉴定［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 60-64.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613011. http://www.spkx.net.cn
CHEN Lu， CHEN Jiwang， CAI Jun， et al.Separation， purification， and purity identification of Cd-binding protein from rice［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 60-64.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011.http://www.spkx.net.cn
近年来我国出现的镉污染问题有许多报道，有针对性的检测和研究工作开展较多［1］。研究者对我国20世纪80年代确认的南方某省的土壤镉污染进行了研究，检测了蔬菜、粮食、肉类、禽蛋等样品中的镉含量，研究结果显示肉类、禽蛋样品中镉含量均未超标，不同种类的蔬菜镉含量的超标率各不相同，粮食中的大米镉含量的超标率高达63.5%［2］，大米中重金属超标已是迫切需要解决的问题［3］。
镉可与食品成分结合呈现络合态。研究发现污染地区贻贝体内的镉以与分子质量约60 kD的蛋白质结合形态存在［4］；大豆中的镉与蛋白质以结合的形态存在，其分子质量在150～200 kD以上，约占大豆总镉的30%。经研究发现大豆蛋白可络合镉从而缓解了毒性［5］，因此，研究大米镉结合蛋白（rice cadmium binding protein，RCBP）具有重要的现实意义和实际价值。
目前国内外对镉与不同来源的蛋白质结合形成的镉结合蛋白已有很多报道，已发现了海洋动物［6-8］、昆虫［9］、小鼠［10］等动物源以及大豆［5］、亚麻籽［11］、玉米［12］、柱状田头菇［13］等植物源镉结合蛋白，其中富含巯基、能螯合大量金属离子的金属硫蛋白的研究较多，研究方法也比较成熟。1957年，镉结合蛋白首次由Margoshes等［14］从马的肾脏皮质中分离得到，分析成分发现该镉结合蛋白质中硫元素含量较高。Pedersen等［15］依次采用离子交换树脂树脂Q Sepharose、凝胶层析Superdex 30纯化大麦虫中的镉结合蛋白，得到一个表观分子质量为7 500 D的镉结合蛋白；Winge等［10］采用Sephadex G-75纯化大鼠肝脏中的镉结合蛋白，分析氨基酸组成发现该镉结合蛋白是金属硫蛋白。但植物源镉结合蛋白的研究处于初步阶段，有关RCBP的研究未见报道。孔庆新［16］和杨居荣［17］等的研究分析了稻谷中镉的分布位置及大米中镉以结合蛋白质的方式存在，尚未分析镉结合蛋白的理化性质及镉与大米蛋白的结合机理。
本实验通过分析不同品种及加工精度大米中的镉含量，选用一种镉含量较高的大米为原料。根据Osborne分级法提取大米中的4 种蛋白质组分：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分析4 种蛋白质组分中的镉含量。提取镉含量较高的大米蛋白组分，经超滤分离，离子交换色谱纯化，制备出纯度均一的RCBP，以期为研究RCBP的形成机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
X1～X5（籼米）、J1～J5（粳米）、N1～N5（糯米） 武汉市武商量贩常青花园店；X6～X9（籼稻） 武汉市粮库。
甘氨酸、考马斯亮蓝R-2 5 0、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、NaCl、盐酸 国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白 上海碧云天生物技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）metyl aminomethane，Tris） 美国Sigma公司；DEAE-Sephadex A-25 美国Pharmacia公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DDS-11C电导率仪 上海雷磁仪器厂；LD5-10型离心机 北京医用离心机厂；LG-3型冷冻干燥机 芜湖万通集团；Φ3.0 cm×30 cm玻璃层析柱 武汉集思仪器设备有限公司；HD-3紫外检测仪、BSZ-100自动部分收集器、HL-2S恒流泵 上海沪西分析仪器厂；FD-1冷冻干燥机 天津仪器公司；TAS-990原子吸收光谱仪（配GFH-990石墨炉） 北京普析通用仪器有限责任公司；Bio-Rad Mini-PROTEAN-3电泳仪（配电泳槽） 美国Bio-Rad公司；超滤装置（膜面积为0.2 m2，截留分子质量5 000 D） 上海亚东核级树脂有限公司；RE52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 大米及其蛋白质中镉含量的测定
采用石墨炉原子吸收光谱法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS），湿法消化［18］。
1.3.2 不同品种大米选取
选取籼米、粳米和糯米各3 种，大米去杂质，超纯水洗净，晾干，磨碎，过80 目筛，贮藏于密封袋中，测定其镉含量。
1.3.3 不同加工精度大米制备
碾米：分别设定不同的检验精米机碾白时间，每次用天平称取20 g糙米倒入检验精米机，碾削得到精米，在这一过程中碾米时间不同，得到碾削程度不同的精米。
检验：采用品红石碳酸溶液染色法［19］对所有大米样品进行样品加工精度等级判断，分别制备出糙米、一等米、二等米和三等米，大米去杂质，超纯水洗净，晾干，磨碎，过80 目筛，贮藏于密封袋中，测定不同加工精度大米的镉含量。
1.3.4 4 种大米蛋白组分的提取
参考Osborne分级法提取大米中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组分，具体提取步骤见图1［20］。测定4 种大米蛋白组分的镉含量。
1.3.5 超滤分离
采用上海亚东核级树脂有限公司生产的内压式聚砜中空纤维超滤膜，膜面积为0.2 m2，截留分子质量5 000 D。取4 种大米蛋白中镉含量最高，为0.7 mg/mL大米蛋白液5 L，超滤膜对该大米蛋白液分离、浓缩，浓缩倍数为5 倍，测定超滤浓缩液中蛋白质及镉含量。
1.3.6 离子交换色谱纯化
采用DEAE-Sephadex A-25多孔凝胶作为固定相，纯化色谱条件：先用起始缓冲液进行洗脱，起始缓冲液为pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，洗脱体积为100 mL；再用离子浓度从0～1 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液线性洗脱，洗脱体积为450 mL；最后用2 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HC1缓冲液进行洗脱，洗脱体积为50 mL。洗脱速率为1.5 mL/min、检测波长为280 nm。
利用连续梯度混合器，分步收集100 个组分，每个组分相当于约1%总梯度体积，在280 nm波长处测各组分的吸光度以确定蛋白质峰。
1.3.7 透析脱盐
将透析袋放在3 L盛满蒸馏水的烧杯中，置室温下透析，每隔4～5 h更换一次烧杯中的蒸馏水，更换两次，再隔夜透析一次，换水前后均测电导率，直至透析外液的电导率接近蒸馏水时，终止透析。
1.3.8 干燥
采用旋转蒸发仪，水浴温度设为40 ℃，蒸发浓缩除去大部分水分。先将浓缩好的样品置于－18 ℃冷冻过夜后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
1.3.9 SDS-PAGE分析
蛋白质质量浓度均为10 mg/mL的提取、超滤和离子交换层析制备的RCBP分别于1.5 mL离心管中，加入5×SDS的上样缓冲液20 μL，混匀，沸水浴10 min，冷却待用。将10 μL样品注入样品池，电压先调到60 V，40 min后改为110 V。采用12%分离胶、5%浓缩胶，用0.1%考马斯亮蓝R-250染色，10%醋酸-5%乙醇洗脱液脱色，直至蛋白条带清晰［19］。
1.4 数据处理
所有数据应用Excel软件、Origin软件及SPSS软件进行处理和分析。采用方差分析（analysis of variance，ANOVA），并采用Duncan's检验进行显着性分析。
2 结果与分析
2.1 不同品种和加工精度大米的镉含量分析
采集15 个武汉当地市售常用大米样品，采用GFAAS法测定其镉含量，测定结果见表1。单样本K-S检验分析大米中镉含量得：P＞0.05，即数据呈正态分布，其镉含量范围为21.86～213.43 μg/kg，平均值为97.14 μg/kg，中位数为78.33 μg/kg，平均值和中位数均低于国家标准限量（200 μg/kg）［21］，20%籼米样品镉含量超标。
从品种上分，粳米的镉含量范围为21.86～80.94 μg/kg，平均值为4 9.9 3 μ g/k g，籼米的镉含量范围为151.74～213.43 μg/kg，平均值为176.80 μg/kg，糯米的镉含量范围为26.51～108.50 μg/kg，平均值为64.72 μg/kg，根据现有大米样品分析结果得出，籼米的镉含量高于粳米和糯米，糯米的镉含量高于粳米。
注：表中结果均以干基计。下同。
选取4 种籼米，由糙米依次加工成三等大米、二等大米和一等大米，测定其镉含量，结果见表2。随着加工精度的增加，同种大米中的镉含量依次降低，不同品种的大米降低程度不同，4 种不同加工精度大米中的镉平均值按照糙米、三等大米、二等大米、一等大米的顺序分别为215.31、173.64、156.06、142.72 μg/kg，糙米和一等大米差异显着（P＜0.05），说明加工精度在一定程度上影响了大米中的镉含量。其中，将糙米加工到一等大米，能显着性降低大米中镉含量。这可能是大米中的有机镉主要是镉结合蛋白，蛋白质在稻米中呈不均匀分布，在胚及糊粉层中含量较高，胚乳中较低，一等大米主要是稻米的胚乳部分，90%以上的糊粉层及胚被除去。但糙米的平均值为215.31 μg/kg，高于国家标准限量（200 μg/kg）［21］，因此选用籼糙米研究镉结合蛋白的形成机理具有现实意义。本研究选取镉含量最高的籼糙米X9为实验原料，提取镉结合蛋白。
注：同行小写字母不同表示差异显着（P＜0.05）。
2.2 4 种大米蛋白组分中的镉含量
根据镉Osborne分级法提取4 种大米蛋白组分，测定镉含量，结果见表3。镉在4 种大米蛋白组分中的含量差异明显，镉含量分别为0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中镉含量最高，其次为醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白。与杨居荣等［17］得出可溶于水的清蛋白中镉的浓度较高的结论类似。该结果表明镉更易与清蛋白和醇溶蛋白相结合，因此制备镉结合蛋白时，对清蛋白进行分离纯化更容易得到目标镉结合蛋白。
表 3 4 种大米蛋白中镉含量（x±s，n=3）Table 3 Cadmium contents in four rice proteins （x±s，n= 3）蛋白质种类 蛋白质质量/g 镉质量/μg 镉与蛋白质质量比/（μg/g）清蛋白 0.66±0.01 0.44±0.00 0.66球蛋白 0.81±0.01 0.25±0.00 0.31醇溶蛋白 0.44±0.01 0.28±0.00 0.63谷蛋白 5.19±0.02 1.19±0.01 0.23
2.3 超滤前后清蛋白的成分变化
大米清蛋白（rice albumin，RA）超滤前后蛋白质和镉质量变化结果见表4。蛋白质的损失率为6.65%，镉的损失率为8.28%，蛋白质和镉的损失率未超过10%，说明超滤可用于浓缩RA。
注：同列小写字母不同表示差异显着（P＜0.05）。
2.4 离子交换色谱纯化
采用DEAE-Sephadex A-25离子交换色谱纯化大米超滤清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA）中的镉结合蛋白，RUA质量浓度为50 mg/mL，上样量5 mL，收集不同的组分，结果见图2。样品的部分收集组分在280 nm波长处的吸光度变化出现3 个紫外吸收峰，得到组分a、b、c。
2.5 纯化各组分中蛋白质及镉含量分析
离子交换色谱纯化RUA得到的组分a、组分b和组分c及组分经透析脱盐、冷冻干燥得到固体组分a、组分b和组分c。取各组分0.1 g，测定其蛋白质质量和镉含量，并计算各组分中蛋白质含量、镉质量及每克蛋白质中含有的镉质量，结果见表5。3 个组分的蛋白质含量差异不明显，均为82 mg左右，而镉含量差异明显。组分a、组分b和组分c中，每克蛋白质中镉质量分别为498.99、574.61 ng和2 309.95 ng，组分c中每克蛋白质中镉质量是组分a、组分b的6 倍左右，即组分c的持镉能力远高于组分a和组分b，因此确定组分c是目标镉结合蛋白，且DEAE-Sephedex A-25凝胶层析色谱可以用于RCBP的纯化。
表 5 组分a、b、c中蛋白质和镉的质量Table5 Contents of protein and cadmiumin fractions a， b and c样品 蛋白质质量/mg 镉质量/ng 镉与蛋白质质量比/（ng/g）a 82.05 40.91 498.99 b 81.14 46.54 574.61 c 83.32 191.73 2 309.95
2.6 SDS-PAGE分析
采用SDS-PAGE鉴定RA、RUA和组分c的纯度以及测定分子质量，RA、RUA和RCBP的SDS-PAGE图谱如图3、4所示。由图3可知，RA、RUA在35、20、14 kD附近有条带，在14 kD出现的条带最清晰，RA的电泳结果与李亦蔚［22］报道的基本一致。组分c显示出一个单一的条带14 kD（图4），去除了35、20 kD的蛋白质，说明该提取、分离及纯化方法能制备出纯度均一的RCBP，即组分c。Thomas等［23］从鳟鱼的鳃部、肝脏组织中分离出分子质量分别为13.5 kD和14 kD的两种非金属硫蛋白。Meisch等［24］从菌类中提取出一种镉结合蛋白，分子质量约12 kD。Dohi等［25］从海螺体内提取了分子质量分别为8 kD和13 kD的两种镉结合蛋白。杨红玉等［26］通过镉诱导绿藻中的蛋白质，成功提取了两种分子质量分别为12.6 kD和12.0 kD的镉结合蛋白。RCBP的分子质量与上述研究者研究的镉结合蛋白的分子质量类似，是一种低分子质量的镉结合蛋白。
3 结 论
分析15 种武汉当地市售常用大米样品中镉含量显示，籼米中镉含量高于糯米及粳米；随着加工精度的增加，糙米和一级大米差异显着，说明品种和加工精度明显影响大米中的镉含量。清蛋白中镉浓度最高，其次为醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白，表明镉更易与清蛋白结合，因此制备镉结合蛋白时，对清蛋白进行分离纯化更容易得到目标镉结合蛋白。采用超滤、离子交换色谱从RA中分离纯化得到目标镉结合蛋白（组分c），SDS-PAGE鉴定组分c为单一蛋白质组分，其分子质量为14 kD，说明超滤、离子交换色谱是分离纯化RCBP的良好手段。
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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）13-0060-05
收稿日期：2015-12-26
基金项目：粮食公益性行业科研专项（201513006-3）；武汉轻工大学重大项目培育专项（2011Z05）；武汉市国际合作项目（201231234466）；湖北省自然科学基金面上项目（2014CFB888）；武汉轻工大学研究生创新基金项目（2012cx012；2013cx011）
作者简介：陈露（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail：loiscl@126.com
*通信作者：陈季旺（1970—），男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：jiwangchen1970@126.com
Separation， Purification， and Purity Identification of Cd-Binding Protein from Rice
CHEN Lu1， CHEN Jiwang1，2，*， CAI Jun1， DING Wenping1，2， WU Yongning1，3
（1.College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products， Wuhan 430023， China；3.National Center for Food Safety Risk Assessment， Beijing 100021， China）
Abstract:A graphite furnace atomic absorption spectrometry （GFAAS） method was used to determine the cadmium content in rice grains from different varieties and at milling levels， as well as in four rice seed storage proteins （albumin， globulin，prolamin and glutelin） obtained through the Osborne sequential extraction method.Moreover， rice cadmium-binding protein （RCBP） was separated and purified to homogeneity by using ultrafiltration and ion exchange chromatography.The purity and molecular mass of RCBP were identified.The results showed that the cadmium content in indica rice was higher than that in glutinous rice and japonica rice and the cadmium content in rice decreased with the increase of milling level.The cadmium contents of rice albumin， globulin， prolamin， and glutelin were 0.66， 0.31， 0.63 and 0.23 μg/g， respectively.RCBP （fraction c）with high purity and good homogeneity as well as molecular mass of 14 kD was prepared from rice albumin （RA）.
Key words:rice Cd-binding protein； separation and purification； ion exchange chromatography； molecular mass
