李秀明，马俪珍*
（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384）
硝酸盐和亚硝酸盐与人类生活密切相关，常应用于腌肉制品中，具有防腐、发色等作用，而蔬菜作为人体日常维生素和纤维素的主要来源，含有较多的硝酸盐，且硝酸盐会在一定条件下还原为亚硝酸盐[1]。大量的亚硝酸盐进入人体后，将携氧的肌红蛋白转变为高铁肌红蛋白，使人体组织缺氧，出现肠源性青紫症，引发急性中毒，同时也会和人体内的胺类结合生成亚硝胺等致癌物[2]，在给食品带来良好色泽和货架期的同时也给人体健康带来了危害。根据国家限量标准，在肉制品中，硝酸盐最大添加量为0.5 g/kg，亚硝酸钠（钾）最大残留量均为30 mg/kg；亚硝酸盐最大添加量为0.15 g/kg，除西式火腿类亚硝酸钠最大残留量不超过70 mg/kg，肉罐头类不超过50 mg/kg，其他肉制品均不应超过30 mg/kg[3]。
硝酸盐常用的检测方法有镉柱还原法、紫外分光光度法[4]、离子色谱法[5-6]等，亚硝酸盐常使用盐酸萘乙二胺法[7]。但操作过程耗时较长，操作相对繁琐，对于需要快速检测的样品不适用。特别是测定硝酸盐时常用的镉柱还原法，实验过程繁琐，不易控制镉柱的还原率，导致测定结果不准确。快速检测技术虽已经在逐渐发展[8]，但其灵敏度和精确度仍得不到保证，因此寻找一个简便、快捷、高效的检测方法具有十分重要的意义。
高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近几年发展最快的分析方法之一，其利用高压电场，以电渗流（electro-osmotic flow，EOF）为驱动力，毛细管为分离通道，根据各组分淌度及分配上的差异对样品进行分离[9]。进样端无死体积，分离过程中也无传质阻力的影响，其EOF为平流，在分离中不发生峰展宽的现象，分离效率高；分离模式和检测方式灵活多变；具有分析速度快、高选择性、样品及试剂消耗量少等优点[10]；若使用缓冲容量较大的分离缓冲液，只需少量即可多次使用；环境友好方面，HPCE通常只需简单的缓冲盐即可实现分离，如硼酸盐、磷酸盐。目前HPCE多数用于蛋白质、氨基酸等的检测[11-12]，在硝酸盐和亚硝酸盐检测方面的研究应用相对较少。有部分学者将HPCE用于一些含盐量低的样品，如任红星等[13]利用自组装毛细管电泳装置实现3 min内测定水中的和，李珊等[14]利用HPCE在6 min内使蔬菜样品中和分离；Merusi等[15]考虑到硝酸盐与亚硝酸盐进入人体食物的来源，利用极低pH 2.5的缓冲液在5 min内实现对糖类及纤维素中硝酸盐、亚硝酸盐和草酸根的测定；Attila等[16]则将HPCE用于对唾液的测定中，为进一步研究提供基础，且体现出HPCE分离效率高的优点。对于基质较为复杂的肉类样品，ztekin等[17]利用涂有聚乙烯亚胺的毛细管实现肉制品中和分离，重复性好且分离速度快，但同时也增加了实验成本；Jastrzębska[18]用毛细管区带电泳法实现了肉中和的测定。但对于高盐含量的样品，如咸菜、腌肉类制品中硝酸盐和亚硝酸盐的毛细管电泳检测方法研究则鲜有报道，且由于Cl-容易对的测定产生干扰[19]，亦是测定高盐含量样品中和存在的难点。本研究目的在于利用HPCE的优点解决常规测定果蔬和肉制品中硝酸盐与亚硝酸盐过程繁琐、耗时长的问题，特别是肉制品中硝酸盐的测定，以达到便捷、快速的目的；同时也对排除Cl-干扰方式进行了研究，使HPCE不局限于低盐含量的样品，亦能测定常见的高盐，且由于硝酸盐与亚硝酸盐含量较高容易引发食品中毒的样品如咸菜、腌肉等，具有较强的实际意义，使得快速准确的检测成为可能，简化了实验步骤，提高了实验效率，为食品的安全监测提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
P/ACE MDQ HPCE（配备紫外检测器） 美国贝克曼库尔勒公司；熔融石英毛细管柱（总长度40 cm，有效长度30 cm，内径50 μm） 河北永年光导纤维厂；PB-10酸度计 德国赛多利斯科学仪器有限公司；LLJ-A10T1搅拌机 广东小熊电器有限公司；HS07-314恒温水浴锅 天津华北实验仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
硝酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钾 天津市北方天医化学试剂厂；硼酸、氯化钠、氢氧化钠、盐酸 天津市风船化学试剂科技有限公司；无水硫酸钠 天津市津东天正精细化学试剂厂；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromid，CTAB） 北京索莱宝科技有限公司；分析过程所有用到的水均为Mili-Q超纯水。
1.3 方法
1.3.1 电泳条件
毛细管柱活化程序：1 mol/L NaOH溶液冲洗20 min；1 mol/L HCl溶液冲洗20 min；超纯水冲洗10 min。
每次进样前冲洗程序：1 mol/L NaOH溶液冲洗3 min；超纯水冲洗2 min；分离缓冲液冲洗2 min。
条件：紫外波长214 nm，正极端进样，进样压力0.5 psi（即3 447.4 Pa），进样时间5 s，分离温度25 ℃，分离电压-5 kV，工作电流约62 µA。
分离缓冲液：400 mmol/L硼酸（2 mol/L KOH溶液调pH 9）+100 mmol/L Na2SO4+0.5 mmol/L CTAB。
准确称取0.247 g的硼酸于50 mL离心管中，加入少量超纯水溶解，用2 mol/L KOH溶液调pH 9，分别加入2.5 mL 400 mmol/L Na2SO4、0.5 mL 10 mmol/L CTAB溶液，用超纯水定容至10 mL。
1.3.2 样品制备及前处理
水果、蔬菜及肉制品（C l-含量均应小于500 mmol/L）通过搅拌机粉碎匀浆以备用。
果蔬及肉制品样品：取1 g样品，加入超纯水约5 mL，于50 ℃恒温水浴锅中水浴15 min后，取出冷却至室温，用超纯水定容至10 mL，用滤纸过滤，滤液用0.22 µm孔径滤膜过滤即可上机（可适当调整试样的稀释倍数）。
1.3.3 加标回收率
采用样品加标回收的方法，分别称取4 份质量为1.000 g的样品，一份不加入混标，另外3 份分别加2、4、6 µg/mL硝酸钠和亚硝酸钠混标，按照样品前处理方法进行，然后用优化的实验方法检测，计算加标回收率。
1.3.4 标准曲线的绘制
将硝酸钠与亚硝酸钠干燥至质量恒定，分别准确称取1.000 g和0.100 g，加水溶解并定容至500 mL，配制为2 000 µg/mL和200 µg/mL质量浓度的硝酸钠与亚硝酸钠标准储备液。对于肉类样品，可将两种储备液均梯度稀释为0.2、0.5、1、5、10、20、40 µg/mL质量浓度的标准混合使用液；对于果蔬类含硝酸盐较高的样品，可将硝酸钠标准储备液梯度稀释为2、5、10、50、100、200、400 µg/mL，亚硝酸钠标准储备液梯度稀释为0.2、0.5、1、5、10、20、40 µg/mL，将两者混合制得标准使用液。按照最适分离条件分析，制作以峰面积为横坐标，硝酸钠和亚硝酸钠质量浓度为纵坐标的标准曲线。
1.3.5 检出限的确定
最低检出限指某种分析方法能从待测样品中检测到的最低质量浓度。参照刘威[20]的方法进行测定，将一个已知浓度接近于空白的标准品多次测定，得到测量读数的标准偏差与平均值，以信噪比为3时，确定仪器检出限。用相应于仪器检出限3～5 倍的质量浓度配制标准溶液，根据样品所有分析过程进行操作，且多次测定计算方法的检出限。计算公式如下：
式中：k为置信因子，取3；Sb为空白标品多次测定读数的标准偏差；C为测量质量浓度/（µg/mL）；X为空白多次测量读数平均值，即峰面积。
1.3.6 精密度检测
取10 µg/mL的硝酸钠和亚硝酸钠标准品，分别在日内和日间进行平行测定3 次，计算两个被测物日内和日间3 次测定峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD越低，说明方法的精密度越高，实验结果越准确。
1.4 数据分析
用32 Karat Software、SigmaPlot 10.0作图，Statistix 8.1对结果进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 分离缓冲液pH值的选择
由于亚硝酸盐不稳定，在酸性条件下易被分解，因此在选择分离缓冲液时需考虑到其pH值，应选用缓冲范围为碱性的缓冲盐。根据弱酸和弱碱的pKa，估算得到常用缓冲盐如磷酸盐的缓冲范围为pH 1.12～3.12、pH 6.2～8.2、pH 11.36～13.36，硼酸盐的缓冲范围为pH 8.24～10.24[21]，结合Frazier等[22]研究的未涂层熔融石英毛细管内EOF和pH值的关系曲线可知，若要获得良好的定量及重复性，应尽量使用pH值小于3和pH值在8～10的分离缓冲液，当pH值大于10时，将会很容易吸收空气中的CO2，因此本实验选择了硼酸为分离缓冲液。但硼酸初始值为酸性，选择一种碱调节剂是至关重要的。根据王茜等[23]对不同碱调节缓冲盐pH值时电导率的测定，得到电导率从大到小顺序为CsOH＞KOH＞NaOH＞LiOH，其中CsOH电导率最大。在选择分离缓冲液时，需要注意分离缓冲液的电导应大于样品缓冲液的电导，且电导差异越大，样品分离度越高，因此电导率最大的CsOH应是不错的选择，但出于实验条件及成本的考虑，本实验选用了电导率较大的KOH作为碱调节剂。
由于本实验选用硼酸作为分离缓冲液，其pH值缓冲范围为8.24～10.24，因此本实验对pH值为8.5、9、9.5、10的背景电解质进行筛选，同时保证其他实验条件相同。图1表明，随着pH值的升高，EOF会逐渐增加[21]，电子迁移速度加快，被测物出峰时间缩短，分离电流不断变大，响应值却逐渐变小，但均能实现较好的分离，其中的峰先到达检测窗口。这是由于本实验采用了电极反向的方式，同时添加了EOF改性剂，被分析物为带相同电荷的阴离子，相对分子质量大的阴离子向正极移动的速度较慢，而EOF的方向同阴离子移动的方向一致，因此相对分子质量小的则先被推送至窗口。由于分离过快导致响应值变低，同时为了避免电流过高，并未对pH 10进行筛选，最终选择最佳pH 9，分离时间相对较快，且响应值高。
图1 不同pH值分离缓冲液对硝酸钠与亚硝酸钠混标分离的影响Fig.1 Effect of buffer pH on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite
2.2 分离缓冲液浓度对分离的影响
分离缓冲溶液的浓度对待测物的分离度、检测灵敏度、工作电流都有着重要影响。当分离缓冲液浓度较低时，会与样品缓冲溶液不匹配，两者电导差异不大，无法实现有效分离，且缓冲容量不足，导致测定结果不稳定，需勤换分离缓冲液[24]；若浓度过高，会产生大量的焦耳热，EOF降低，使被测物的分离度、响应值、检测灵敏度下降，因此在探索方法时有必要对分离缓冲液的浓度进行筛选，以得到最佳分离条件。本实验预将对500、400、300、200、100 mmol/L浓度的硼酸进行筛选，其余条件均保持一致。如图2所示，当硼酸缓冲液浓度为300～500 mmol/L范围时，硼酸浓度越低，出峰时间越早，响应值越低，分离度变小。观察缓冲液浓度为300 mmol/L时的峰形变化，的峰形已经变差，峰展宽且响应值急剧降低，因此未继续对100 mmol/L和200 mmol/L浓度的硼酸进行比较。从图2可以看出，400 mmol/L和500 mmol/L均能实现较好的分离，但是为防止产生过多的焦耳热，应选择能够有效分离并且浓度相对较低的缓冲盐浓度，因此本实验选用400 mmol/L为分离缓冲液中硼酸的最适浓度。
图2 硼酸浓度对硝酸钠与亚硝酸钠混标分离的影响Fig.2 Effect of boric acid concentration on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite
2.3 EOF反向剂浓度的选择
和均为无机阴离子，带负电，在电离时，阴离子总是向正极移动，在电极正向时EOF由正极走向负极，而检测窗口靠近负极，故会导致阴离子到达检测窗口的时间延长，并且和的淌度较大，更容易出现不能在合理时间内出峰的现象[25]。故为快速有效地分离，应选用EOF改性剂CTAB[26]，在改变EOF方向的同时，又采用反向电压，使得待测离子与EOF移动方向一致，缩短了分离时间。根据Reinhard等[27]的研究结果，当CTAB浓度为0.35 mmol/L时，可达到EOF反向的作用，因此本实验分别对0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L添加量的CTAB进行筛选。如图3A所示，随着CTAB浓度的增大，两个阴离子峰的分离度逐渐变大；对比0.4 mmol/L浓度的电泳图，另外3 个浓度的出峰时间稍微提前，三者出峰时间差异不大；而响应值变化如图3B所示，在CTAB为0.5 mmol/L浓度时达到最大，且随浓度的继续增大，响应值呈降低趋势。综合来看，0.5 mmol/L的CTAB为最适添加量。
图3 CTAB浓度对硝酸钠与亚硝酸钠混标的分离（A）和与峰面积（B）的影响Fig.3 Effect of CTAB concentration on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite (A), and peak areas of and (B)
2.4 排除Cl-干扰方法分析
将上述优化出的最适分离缓冲液（400 mmol/L硼酸+2 mol/L KOH溶液调pH 9+0.5 mmol/L CTAB）应用于实际样品（如洋白菜和红肠）的测定，结果如图4所示，发现两者的峰形较好，但在红肠样品图4B中出峰位置有杂峰干扰现象，无法得到亚硝酸盐的含量。经查阅文献资料，如在陆莹等[19]研究得到当质量浓度小于0.5 mg/L时，干扰会随着Cl-、质量浓度比的增大而增加；肖双等[28]提到Cl-和与固定相的亲和力相近，保留时间相似，而当Cl-含量较高时，会干扰的测定，同时还介绍了可以采用过Ag柱和Na柱的方式去除Cl-；姜廷福等[29]在测定腌菜中硝酸盐与亚硝酸盐时通过在分离缓冲液中添加2 倍样品NaCl的方式降低高浓度盐对的干扰。根据以上资料结果，并且经过加标验证，得到该杂峰的确是由Cl-造成的。究其原因，是由于样品中的高浓度盐破坏了电堆积效应，使样品溶液的电导与分离缓冲液的电导差异变小，两者电导值不匹配，而一些样品中含盐量较高，不能通过简单改变分离缓冲液浓度或者电压使其较好地分离。经查阅资料，可从以下两个方面探索消除Cl-干扰：1）对样品进行前处理（如过固相萃取小柱Ag柱）去除Cl-[30]；2）在分离缓冲液中添加中性盐[19]，从而保持其离子强度，增大电导差异。为降低成本，实验分别通过在样品滤液中添加AgNO3和在分离缓冲液中添加Na2SO4测定含盐样品硝酸盐和亚硝酸盐的方法。
图4 分离洋白菜（A）和红肠（B）中硝酸盐与亚硝酸盐的毛细管电泳图谱Fig.4 Capillary electrophoresis chromatograms of nitrate and nitrite in cabbage (A) and red sausage (B)
2.4.1 添加AgNO3的影响
图5 向含有40 mmol/L NaCl的10 µg/mL硝酸钠与亚硝酸钠混标中添加50 mmol/L AgNO3的毛细管电泳图谱Fig.5 Capillary electrophoresis chromatograms of 50 mmol/L AgNO3 added to the mixture of 10 µg/mL sodium nitrate and sodium nitrite containing 40 mmol/L NaCl
通过添加AgNO3的方式排除Cl-干扰。根据Ag+可以和Cl-反应生成AgCl沉淀，猜想通过添加硝酸银的方式去除Cl-，以此降低Cl-对的干扰，虽然同时加入了，但可通过检测到的总量减去加入量来获得实际含量。但实验结果表明，当AgNO3添加量大于Cl-含量时，如图5所示，能够改善Cl-干扰，但Ag+的强氧化性，将部分氧化，响应值变低，峰面积增大且峰展宽，两者峰形均不好。若将此方法应用于实践中，需先测出样品中Cl-含量，再根据所需等比例将AgNO3加入样品中以去除Cl-，否则当添加量低时，不能完全被Ag+沉淀的Cl-仍会干扰的测定；添加量多时，多出的Ag+可能会氧化，使结果不准确。因此，该方法并不适用也不实用。
2.4.2 添加Na2SO4的影响
配制10 µg/mL含有20 mmol/L NaCl的硝酸盐与亚硝酸盐混标，向分离缓冲液中分别加入20、40、80 mmol/L的Na2SO4，但随着其浓度的增加，为避免工作电流超过100 µA，分离电压也应当相应降低，因此将电压均设为-7 kV。如图6所示，随Na2SO4添加量的增大，缓冲液浓度增加，分离时间逐渐增加，其中由Cl-产生的干扰峰逐渐与的峰分离，且分离度逐渐变大，同时不对出峰产生干扰，可见通过添加Na2SO4的方法可行。根据Na2SO4添加量和NaCl含量的比例可以看出，当Na2SO4、NaCl浓度比为2时，已经能够排除Cl-的干扰，但当Na2SO4添加量较高时，被测物出现峰展宽的现象，这是由于分离电压与分离缓冲液浓度不匹配，分离电压相对较高，此时分离电流已经达到84.3 µA。因此在添加高浓度Na2SO4时，需要对分离电压进行进一步筛选。
图6 Na2SO4添加量对含有20 mmol/L NaCl的硝酸钠与亚硝酸钠混标分离的影响Fig.6 Effect of Na2SO4 addition on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite containing 20 mmol/L NaCl
2.5 分离电压的选择
结合以上优化结果、参考文献中高盐含量样品[26]的含盐量以及本实验中样品前处理方式，以最大能够检测含500 mmol/L NaCl的样品为例，即在分离缓冲液中添加100 mmol/L的Na2SO4，并对分离电压进行优化。当-7 kV时，添加20、40、80 mmol/L Na2SO4的电流分别为52.4、63.1、84.3 µA，预估添加100 mmol/L的Na2SO4电流不会超过100 µA，因此分别对-7、-6、-5、-4 kV电压进行筛选。结果如表1和图7所示，随着分离电压降低，分离时间逐渐延长，响应值逐渐变大，但当分离电压为-4 kV时，两峰峰展宽，不利于分离较低浓度的样品；-7 kV条件下虽出峰时间快，但响应值偏低，且工作电流较大；对比-5、-6 kV分离效果，-5 kV工作电流较低，且响应值较大，峰形好，故确定-5 kV为最适分离电压。
表1 不同电压下分离与时的工作电流、保留时间及峰面积Table1 Operating currents, retention times and peak areas of NO－2 and at different separation voltages
表1 不同电压下分离与时的工作电流、保留时间及峰面积Table1 Operating currents, retention times and peak areas of NO－2 and at different separation voltages
分离电压/kV工作电流/µA NO2- NO3-保留时间/min 峰面积 保留时间/min 峰面积-7 89.5 3.354 5 374 3.575 6 320-6 75.5 3.962 6 075 4.225 7 239-5 61.8 4.629 7 868 5.150 8 980-4 48.4 6.088 9 528 6.496 10 940
图7 电压对硝酸钠与亚硝酸钠混标分离的影响Fig.7 Effect of different voltages on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite
2.6 方法的回收率、线性、检出限和精密度
经过加标检测得到方法的加标回收率、标准曲线和检出限如表2所示，优化出的实验方法加标回收率在81.82%～100.91%之间，线性相关系数均在0.99以上，检出限则分别为0.69 µg/mL和0.50 µg/mL。经日内和日间3 次平行测定，得到方法日内和日间的精密度如表3所示，相对峰面积的RSD在1.4%～3.2%之间，说明该方法的精密度良好。
表2 方法的加标回收率、标准曲线和检出限Table2 Recoveries, standard curve equations and LODs of the method
表3 方法的精密度Table3 Precision of the method
2.7 样品检测结果
用最适实验条件，对一些常见的含有硝酸盐和亚硝酸盐的样品进行测定，对比国标方法，采用盐酸萘乙二胺法检测肉制品中的亚硝酸盐，但用来测定肉类中硝酸盐的镉柱还原法难以实现，还原率不稳定，因此未对肉制品中硝酸盐进行测定；结合紫外分光光度法对蔬菜中硝酸盐的测定结果，如表4所示，本方法与国标法的测定结果基本一致，说明该方法具有可行性。其中芹菜和自制香肠的毛细管电泳图谱分别如图8所示。由测定结果看出，芹菜叶中硝酸盐含量很高，达到（3 115.49±1.41）mg/kg；对于次新鲜状态的圆生菜，部分硝酸盐已经转化为亚硝酸盐，直接威胁人们的健康，同时也说明生活中应尽量食用新鲜蔬菜；自制香肠中的亚硝酸盐达到了（74.13±1.20）mg/kg，已经远超过了国家限量标准，存在着食品安全隐患。可见，对食品中硝酸盐和亚硝酸盐含量的监控是十分必要的，而本研究所建立的方法能够快速准确测定对食品安全有着重要的实际意义。
表4 5 种样品的硝酸盐与亚硝酸盐含量测定结果Table4 Determination of nitrate and nitrite contents in fi ve samples
图8 分离芹菜（A）和自制香肠（B）中硝酸盐与亚硝酸盐的毛细管电泳图谱Fig.8 Capillary electrophoresis chromatograms of nitrate and nitrite in celery (A) and sausages (B)
3 结 论
本研究排除Cl-的干扰，建立了一种能够同时快速检测高盐含量的果蔬及肉制品中硝酸盐和亚硝酸盐的方法，即使用内径50 µm，总长40 cm，有效长度30 cm的毛细管柱，在214 nm条件下，以400 mmol/L硼酸（2 mol/L KOH溶液调pH 9）+100 mmol/L Na2SO4+0.5 mmol/L CTAB为分离缓冲液，分离电压-5 kV，操作温度25 ℃，0.5 psi（即3 447.4 Pa）压力下进样5 s时，可将含盐量500 mmol/L以下的样品在6 min内硝酸盐和亚硝酸盐达到分离，该方法的加标回收率在81.82%～100.91%之间，对于肉类和果蔬类样品，硝酸盐的线性范围分别为0.2～40 µg/mL 和2～400 µg/mL，亚硝酸盐质量浓度的线性范围均为0.2～40 µg/mL，相关系数均在0.99以上，检出限分别为0.69 µg/mL和0.50 µg/mL，精密度不高于3.2%。该方法回收率高、精密度良好、操作简便、快速准确、灵敏度高、成本低，不仅增强了食品安全快速准确监控的可能性，同时利用了HPCE的优点，使其不仅局限于对蛋白、肽、氨基酸等的测定，亦提高了它的实用价值。
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