林晓娜，戴 骐，何卫东，张 芳，张焊宇，魏霄凌，周晓莲，俞梦翔
（浙江省检验检疫科学技术学院，浙江 杭州 310016）
元素化学形态是环境、毒理学和分析领域的一个重要话题[1]。元素形态分析在总量分析的基础上得到了附加信息，包括生物利用度、迁移率、代谢过程、生物转化过程和相关毒性等，通过元素形态分析可以更清晰地理解元素总量的重要性[2-5]。工业废水污染和纺织印染工业中人造纤维织物等行业的发展导致多种毒性或微弱或剧烈的砷化物及其衍生物、铬（VI）等通过地质沉积等地球化学过程进入到土壤和饮用水水源[4]。一些不良生产者和商家在所谓的富硒食品、农产品乃至保健品中添加低成本的无机硒（亚硒酸钠和硒酸钠）而非真正有机硒。砷形态中无机砷毒性高，有机砷被甲基化后不具有毒性[2]。硒和铬是人类生存的必需微量元素，不管是过量摄入或者缺乏都会引起严重的生物学和生态学问题，例如硒过量摄入会导致硒中毒，缺乏则会引发慢性克山病[4]。硒的毒性取决于它的氧化形态和数量。硒的多种存在形态中，单质硒实际上是无毒的，因为它既不易溶解又不易吸收，亚硒酸毒性最强，硒酸次之，硒代氨基酸反而对人体有益[4]。铬无法在人体内合成，只能从外源吸收，同硒一样，铬的缺乏和过量都可能会引起疾病，甚至死亡[6]。铬（VI）很容易出现在土壤-水系统中的生物体[7]。因此砷、硒和铬形态分析比总量分析更为重要，重金属的危害程度取决于其存在的浓度及化学形态[6]。近年来元素形态分析受到了科研部门和商业实验室的重视，应用最多的是高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（high performance liquid chromatography-inductively coupled with plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）和气相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（gas chromatography inductively coupled with plasma mass spectrometry，GC-ICP-MS），对铬（VI）、无机汞、甲基汞、无机砷和有机锡检测均已被美国环保署方法认同。
生活饮用水是人类生活的重要部分，容易受到环境土壤的直接影响。根据中国的饮用水质量标准，砷、铬（VI）和硒的限量分别为0.01、0.05 mg/L和0.01 mg/L，欧盟饮用水条例（98/83/EC）也有相同的要求。
本研究旨在建立一种同时分离和测定生活饮用水中的砷、硒和铬元素形态的方法，为食品中砷、硒和铬的形态分析提供基础研究。有研究报道HPLC-ICP-MS同时测定砷，硒和铬无机形态，但并不是使用单一前处理方法和同时测定的[8]。目前，在众多的联用技术中因HPLCICP-MS具有高效的分离能力和高灵敏度的检测能力，成为元素形态分析中应用最广泛的技术。本实验使用的电感耦合等离子体串联质谱（inductively coupled plasma tandem mass spectrometry，ICP-MS/MS）技术[9-10]，其性能优于单四极杆ICP-MS，具有两个独立质量筛选功能的过滤器，可控且持续的干扰消除能力，不仅具备ORS3氦碰撞动能歧视消干扰的性能，其MS/MS功能还能精确控制进入碰撞/反应池的离子，有效解决了原先传统反应池在使用反应性气体测定复杂基体时因共存基体或元素易形成新的干扰离子或共存离子导致用质量转移法难以获得准确的痕量定量结果等难点，可以有效解决复杂基质中的超痕量元素所受的质谱干扰难题，即使样品组成有所不同，也能保持一致、可预见的反应条件，能始终有效地消除复杂样品中未知元素对超痕量目标元素的干扰[11-13]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
超纯水（18.2 MΩ）制备包括流动相的所有标准品和溶液。
标准物质：砷甜菜碱（arsenic betaine，ASB）（GBW08670，0.518 μmol/g）、砷酸根（arsenate，As（V）GBW08667，0.233 μmol/g）、亚砷酸根（As（III），GBW08666，1.011 μmol/g）、一甲基砷（methyl arsenic，MMA）（GBW08668，0.335 μmol/g）、二甲基砷（dimethyl arsenic，DMA）（GBW08669，0.706 μmol/g）、硒酸根（Se（IV），GBW10033，0.525 μmol/g）、亚硒酸根（Se（VI），GBW10032，0.543 μmol/g）、三价铬（Cr（III），GSB04-1723-2004（e），1 000 µg/mL）、六价铬（Cr（VI），GBW（E）080257，100 µg/mL）。以上标准溶液均购自国家标准物质中心。
0.5 mmol/L EDTA缓冲溶液，用20%氨水调节pH值至7.5。在分析前约1 h用缓冲溶液制备含有混合砷、硒和铬形态标准工作溶液，室温条件下至少反应45 min，最大效率地形成[CrEDTA]-络合物。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity HPLC仪、8800 ICP-MS/MS仪美国Agilent Technologies公司；PRP-X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 µm） 美国Hamilton公司。
1.3 方法
1.3.1 HPLC条件
形态分离采用HPLC仪，在样品流路中采用了无金属部件及溶剂输送无铁、无钢的设计，最大程度上减少了铬形态分析时引入污染。Hamilton PRP-X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 µm）进行分离。HPLC系统的梯度程序见表1。
1.3.2 ICP-MS/MS条件
应用8800 ICP-MS/MS仪，采用1.0 µg/L调谐液优化氦模式（He）和高能He（high energy He，HEHe）模式仪器参数，包括氧化物、双电荷和灵敏度；5.0 µg/L砷、硒和铬标液优化加氧模式参数，包括灵敏度及反应气体流量[14]。仪器的操作条件及参数见表2、3。
表2 HPLC-ICP-MS的仪器条件Table2 Instrumental conditions for HPLC-ICP-MS
表3 ICP-MS/MS不同测定模式下的特殊仪器参数Table3 Special instrumental parameters for different measurement modes of ICP-MS/MS
2 结果与分析
ICP离子源中形成的同质异位素、双电荷离子、氩离子、多原子离子都会对相同质量数的离子测量产生影响，质量数小于80的元素受到干扰尤为明显，75As+、78Se+和52Cr+的质谱干扰有40Ar35Cl+、78Gd++、40Ar38Cl+和40Ar12C+等。降低等离子体功率、提高仪器的分辨率可以消除部分干扰，但其代价是损失灵敏度；碰撞、反应气的引入，也可能形成新的干扰影响因素。本研究使用串联质谱测定砷、硒和铬，在反应池加氧之前先经过第一级四极杆（Q1）进行初筛，在Q1后的碰撞反应池（八极杆）加入氧气，75As+、78Se+和52Cr+与16O反应生成91AsO+、94SeO+和78CrO+，由于Q1的特异筛选作用，m/z 91、94和78的离子和多原子离子（94Zr+、59Co35Cl+）已在Q1时被过滤，未能进入Q2，从而达到彻底消除同质异位素、双电荷离子、氩离子、多原子离子的干扰[15-17]。
2.1 反应气流量优化及消除干扰效果
通过考察在加氧条件下各质量数的背景等效浓度（background equivalent concentration，BEC），使元素的氧化效率最大化，且有效降低背景，同时保证足够的灵敏度（检出限），以5 μg/L的As（75→91）进行反应气体流量优化结果见图1，随着氧气流量增加，As的氧化效率（灵敏度）和BEC均出现先提高后下降的趋势：氧气流量达到45%时氧化效率最大，75As（40 517.73 cps）比He模式下75As（6 225.54 cps）提高6.5 倍，随着反应池中氧气继续增加，产生了空间电荷效应，砷的氧化效率受到抑制；25%的氧气流量时，As（75→91）的BEC最低（0.0128 μg/L），随着氧气流量增加，背景离子的氧化效率提高，BEC提高。Se和Cr的反应气体流量优化结果分别为25%和30%，综合考虑3 种元素的情况，最终确定砷、硒和铬的最佳氧气流量为25%。
图1 反应气（氧气）流量优化结果Fig.1 Optimization of reaction gas (oxygen) fl ow
本研究采用的8800 ICP-MS/MS仪有多种测定模式，包括传统ICP-MS的No Gas模式、以碰撞和动能歧视降低干扰的氦模式（普通He模式和HEHe模式）、以及加氧气为反应气的单杆模式（Q1作为离子导杆，不起到质量筛选作用）和串接模式（使用Q1作为质量过滤器，让特定质量数离子通过）。为研究串接加氧模式在消除干扰的优势，本实验同时研究了砷、硒和铬在4 种测定模式下的仪器检出限和BEC，因砷、硒和铬受载气和基质形成的多原子离子干扰较严重，故不再研究No Gas模式的测定效果。
表4 砷、硒和铬不同ICP-MS/MS测定模式下的检出限和BECTable4 Detection limits and background equivalent concentrations of As, Se and Cr in different assay modes of ICP-MS/MS
表4显示：1）砷、硒和铬在加氧串接模式下的BEC和检出限比其他模式低，说明加氧串接模式灵敏度高，消除干扰的能力最强；2）HEHe模式下BEC比串接模式低，这是因为HEHe模式对该同位素也有较强的干扰消除能力，但由于HEHe模式与He模式都是通过He碰撞实现干扰消除，因此灵敏度相对较差；3）单杆氧模式结果说明引入了其他的质谱干扰，证明了Q1具有质量过滤器作用，对消除质谱干扰和提高灵敏度有很大的作用。因此加氧串接模式能彻底地消除质谱干扰，同时还提高了灵敏度[18]。
2.2 色谱分离条件
常规H P L C使用不锈钢材质，铬质量分数为12%～30%。流动相淋洗时，难免会有微量铬被洗脱，而Bio-HPLC凡是和样品接触的部件均是由钛、陶瓷和聚醚醚酮制成，完全避免了HPLC本身引入的铬污染，因此Bio-HPLC的背景比常规HPLC低一个数量级[19]。
2.2.1 色谱柱选择
色谱分离条件主要包括色谱柱选择和流动相。元素的多数形态均为离子形态，常采用离子交换柱、反相色谱配合离子对试剂进行分离。离子对试剂最大的缺点是对色谱柱不可逆的伤害较大。在生物和环境试样中，元素通常以中性或带电荷的化合物形式存在，这些形态随分析溶液的pH值变化而变化，因此离子交换色谱柱应该是最适宜分离柱。通过文献查阅以及试验确定本研究选用Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱，其他色谱柱留待进一步研究。
2.2.2 流动相的组成
流动相是影响HPLC分离的另一个主要因素，主要优化参数有pH值、有机相、离子对试剂和梯度。流动相的组成选择原则：提供洗脱分析物所需的离子强度，不干扰目标分离物，并且不会导致ICP离子化效率的降低，尽量避免使用钠盐、钾盐等含常量元素。实验发现NH4H2PO4、NH4HCO3和NH4NO3等流动相均能实现砷形态分离，且碳酸盐的分离时间较磷酸盐短，但NH4H2PO4对Se和Cr形态均不洗脱。NH4NO3常用于Cr（III）和Cr（VI）的分离，但NH4NO3是氧化剂，对无机砷和无机硒有氧化作用，初步实验未找到合适的浓度和pH值可用来同时分离砷、硒和铬形态。而NH4HCO3可实现As（III）、As（V）、Se（IV）、 Se（VI）、Cr（III）和Cr（VI）的分离。
在流动相中加入甲醇等有机物能够改进As和Se的灵敏度，但是会在等离子体中形成40Ar13C导致Cr信噪比的显着降低，影响铬的检出限，并且碳积聚还会堵塞ICPMS锥口，增加仪器系统维护工作频率[20]。由于氧气反应气的加入，As和Se的灵敏度已大大提高，因此本实验流动相不再考虑使用有机物。
流动相浓度对分析物的分离时间有影响：实验通过改变NH4HCO3浓度从0.1～10 mmol/L进行等度洗脱，用氨水调节流动相pH 7.5。NH4HCO3浓度低，As（V）、Se（VI）和Cr（VI）的保留时间较长（24 min），浓度提高后As（III）和DMA保留时间缩短，但分离度不佳。使用等度洗脱，砷形态实现良好的基线分离以及短的分析时间是不可行的。通过实验确定使用Hamilton PRP-X100，流动相A为4 mmol/L NH4HCO3溶液和流动相B为0.3 mol/L NH4HCO3溶液梯度程序（表1）的HPLC条件下，可实现多种砷、硒和铬形态的分离。
2.2.3 流动相pH值
基于文献研究，Cr（VI）在碱性条件下因氧化能力降低而更加稳定[12]。水中存在一定量的氯化物，因此在标液中加入1 000 mg/L氯化物作为干扰物研究流动相pH值（研究范围7.0～10.2）对砷、硒和铬形态分离的影响。氯化物形成的干扰物分别为40Ar35Cl+、36Cl16O+和40Ar37Cl+。如图2所示，随着pH值的增加，干扰物保留时间不变，但是砷、硒和铬形态的保留时间有变化。pH 7.5时，Se（IV）与干扰物部分重叠；pH 8.2时MMA受干扰物影响；pH值提高至8.7时MMA与干扰物实现分离；pH 9.2时As（III）作为阴离子化合物存在（pKa9.2），并被固定相保留，随着pH值升高至10.2时，As（III）与MMA完全重合。pH值的变化。氯化物干扰物对铬形态均无干扰。在0～3 min时降低流动相A的浓度，可以实现As（III）与MMA的基线分离。但随着pH值升高，Cr（III）和Cr（VI）的分离变差。
图2 不同pH值下砷、硒和铬形态的分离效果Fig.2 Separation of arsenic, selenium and chromium at different pH values
pH值对砷、硒和铬形态分离非常重要[15]。采用单四极杆ICP MS在克服质谱干扰的情况下，只在pH 8.5时可以同时分离As（III）、DMA、MMA、As（V）、Se（IV）、Se（VI）和Cr（VI）7 种形态，但Cr（VI）和 Cr（III）的峰形和分离效果不佳，需要考虑其他的方式来克服质谱干扰。串联质谱因其高效特异准确的质谱干扰消除能力，可解决这一难题。pH 7.5，采用串联质谱进行测定（图3），结果发现氯化物干扰物未出现在色谱图上，ASB、As（III）、DMA、MMA、As（V）、Se（IV）、Se（VI）、Cr（III）和Cr（VI）实现基线分离，从谱图还能看到砷和硒的灵敏度提高，铬的BEC也有所下降。
图3 HPLC-ICP-MS/MS分离砷、硒和铬形态效果图Fig.3 Separation of different species of arsenic, selenium and chromium by HPLC-ICP-MS/MS
经过质谱条件和色谱条件优化后确认采用生物惰性HPLC，以Hamilton PRP-X100为色谱柱，以4 mmol/L NH4HCO3（A）和0.3 mol/L NH4HCO3（B）为流动相（pH 7.5），梯度洗脱分离砷、硒和铬的9 种元素形态后，ICP-MS/MS进行测定，有效地消除了质谱干扰并提高了灵敏度。
2.3 样品检测结果
适宜的提取方法是形态分析的关键环节，样品基质不同最优的提取方法不同，砷形态按照提取液的不同，可分为水提取、酶提取、甲醇-水提取、Tris-HCl提取、氯仿-甲醇-水提取、稀硝酸提取[21-23]；硒形态的提取，目前有酶水解法、加压液相提取法、HNO3-H2O2微波提取法、水-胃蛋白酶-胰蛋白酶三步提取法等[24-25]。铬形态的提取，有非氧化性无机酸（如HCl、H3PO4）、还原性更弱的有机酸（如乙酸、甲酸等）、碱液（如四丁基氢氧化铵、氨水）、EDTA等[26-28]。
砷和硒的几个形态均以阴离子形式存在，铬元素主要以Cr（III）和Cr（VI）的形态存在。其中Cr（III）是阳离子，Cr（VI）是铬酸根阴离子[29]。在相同条件下，采用一种离子交换方法是不能对这两种离子都起作用的[30]。EDTA是Cr（III）的有效络合剂，前处理时加入EDTA缓冲液能与Cr（III）形成稳定的 Cr（III）-EDTA络合物，Cr（VI）不与EDTA 络合，直接溶于缓冲液中。Cr（III）和Cr（VI）就分别以Cr（III）-EDTA和Cr（VI）形态在色谱柱中分离。
EDTA是一种常用的络合剂，它既能与Cr（III）络合，也能与钙、镁、锌、铁等多种金属离子进行络合，它们之间是一种竞争关系。因此，如果EDTA加入量不够，就会导致Cr（III）的回收率偏低。EDTA与金属离子通常以1∶1络合的。通过实验发现Cr（III）的浓度趋势随着EDTA浓度的增加而增加（图4），EDTA浓度0.5 m o l/L后趋于稳定，因此E D T A浓度确定用0.5 mol/L，同时要用氨水调节水溶液pH 7.5，避免Cr（VI）被还原为Cr（III）。
图4 EDTA浓度对Cr（III）络合影响Fig.4 Effect of EDTA concentration on Cr(III) complexation
Cr（III）与EDTA在常温下络合速度非常缓慢，需要几十小时才能完全络合。随着温度升高，络合速度明显加快。在水中加入10 μg/L的形态混合标液，前处理方法见表5。考察恒温振荡器、微波萃取和超声波提取效果，结果见表6。砷和硒各种前处理方法回收率都较好，这可能是水中砷、硒含量较低，温度提高，Cr（III）的络合时间短。100 ℃条件下能极大地加快络合速度，时间越长，Cr（VI）部分转化为Cr（III），导致Cr（VI）回收率下降。因此，100 ℃微波萃取2 min后Cr（III）能与EDTA完全络合。
表5 水的前处理方法Table5 Pretreatments for water samples
表6 不同制备方法的砷、硒和铬回收率结果Table6 Recoveries of arsenic, selenium and chromium with different preparation methods
2.4 检出限、精密度和回收率实验结果
9 种元素形态在0～50 μg/L范围内线性良好，线性相关系数大于0.999。根据峰面积信噪比实验确定检出限分别为0.023（AB）、0.056（As（III））、0.032（DMA）、0.064（MMA）、0.061（As（V）），0.091（Se（IV））、0.089（Se（VI））、0.21（Cr（III））、0.18（Cr（VI））μg/L。各元素检出限远低于中国饮用水水质标准限量。通过3档加标5 次平行的回收率（72%～119%）和精密度（0.23%～11.9%）实验，结果均符合要求，见表7。
表7 砷、硒和铬形态的回收率和精密度结果（n=5）Table7 Recovery and precision of arsenic, selenium and chromium species from spiked water samples (n= 5)
应用本方法测定了来自杭州不同区域的10 个地表水，情况如下：所有水中均未检出MMA和ASB，有4 个水检出DMA，7 个水检出AsV，9 个水检出As（III），检出的砷形态浓度大致在0.1～2.0 μg/L；所有的硒均未检出；有1 个郊区的水检出了8 μg/L的Cr（VI），经调查，可能是该区域之前有个化工厂导致的污染。
3 结 论
本研究采用微波萃取结合HPLC-ICP-MS/MS法测定生活饮用水中的砷、硒和铬形态，针对饮用水中的As（III）、As（V）、ASB、DMA、MMA、Se（IV）、Se（VI）、Cr（III）和Cr（VI）进行了分离检测。使用NH4HCO3进行梯度洗脱，在13 min内完成分离检测。本方法的建立为食品中砷、硒和铬的同步分离提供了理论支持。
