单宁酶固定化及其降低蓝靛果汁口腔染色作用分析

韩春然，张家成,*，王 鑫，那治国，戴传荣，王佳宁，谢静南

单宁酶（EC3.1.1.20）又称单宁酰基水解酶，是在单宁酸等条件下合成的诱导酶。单宁能被单宁酶水解成葡萄糖和没食子酸[1-2]，主要用来处理单宁所引起的涩味等不好影响。由于单宁酶的大量生产较为困难、使用率低、稳定性差等原因，从而导致其价格昂贵[3-4]。应用固定化技术对其进行研究，经过酶的固定化后不仅可以重复使用，还可提高酶的各方面性质，这对于将单宁酶进行连续化催化反应很有意义[5-7]。单宁微球具有多孔、易回收、比表面积大和可再生等特点[8]，可显着加强单宁的工业应用，单宁酸在蓝靛果中为含量较高的一种酚类化合物，制得的单宁微球易于分散和吸收[9-12]。

蓝靛果中含有大量的单宁，但在果汁生产中的缩合单宁可影响口感、色泽和澄清度，也因其可与口腔黏膜和唾液蛋白结合生成沉淀，产生涩味，造成舌头表皮膜染色现象，这是广大果汁、饮料中所共同存在的问题之一[13-17]。而水解单宁中的鞣花酸具有抗肿瘤、降脂、抗氧化等多种生物活性，对心脑血管疾病和糖尿病等具有一定的抑制作用[18]。因此，果汁生产中对单宁的水解以获得高含量的鞣花酸，对果汁产品质量的改善具有极其重要的生产价值和理论基础。

本研究得到了固定化单宁酶的制备条件，将固定化单宁酶利用在蓝靛果果汁单宁水解中，并对猪舌上层黏膜的染色进行研究，考察添加固定化酶的蓝靛果果汁对猪舌黏膜的染色能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果（忍冬科，忍冬属） 大兴安岭百盛蓝莓科技有限公司；单宁酶（酶活力为100 000 U/g） 安徽中旭生物科技有限公司；猪舌头 哈尔滨朝阳大市场；鞣花酸（标准品） 上海源叶生物科技有限公司；单宁酸山东浩中化工科技有限公司；液体石蜡、司班85 天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-5200紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；SU8000日立新型扫描电镜（scanning electron microscope，SEM） 天美（中国）科学仪器有限公司；Spetrum 100傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国Thorlabs公司。

1.3 方法

1.3.1 单宁微球固定单宁酶的制备

1.3.1.1 单宁微球的制备

参考卢玉栋等[19]的方法进行制备单宁微球：将5 g/100 mL单宁酸溶液称取20 g，缓慢搅拌加入到装有1 g司班85和40 g液体石蜡的250 mL锥形瓶中，调节pH 10，搅拌30 min后加入1 g质量浓度37 g/100 mL甲醛溶液，在水浴80 ℃中反应1 h；再将反应物静置，冷却、抽滤，依次用丙酮和蒸馏水反复充分洗涤滤物至其滤液到中性为止；将滤物在室温下晾干后，70 ℃真空干燥，最终获得单宁微球。

1.3.1.2 化学交联法制备固定单宁酶

将上述制备好的单宁微球称取0.05 g放入20 mL 0.03 mg/mL的单宁酶溶液中，调节溶液pH值至5.5，25 ℃恒温振荡20 min后加入0.10 g/100 mL戊二醛溶液0.1 g，恒温固化振荡40 min后过滤，分别得到固定单宁酶（滤渣）和酶滤液，滤渣取出用大量蒸馏水和缓冲液洗涤后，放入真空干燥器干燥4 h后取出，测定酶固定化率。

1.3.2 酶活力回收率的测定

取0.002 0 g的固定化单宁酶，参考保玉心等[20]的方法。固定化酶活力回收率计算方法如下式所示：

1.3.3 固定化条件的单因素试验

在锥形瓶中加入0.05 g单宁微球，再加入一定量（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL）的单宁酶液，调pH值（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5），振荡后加入一定质量分数（0.00%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%）戊二醛，固化一段时间（20、30、40、50、60、70 min），固定化处理步骤同1.3.1.2节。测定固定化酶的活力回收率。

1.3.4 固定化工艺条件优化响应面试验

通过单因素的试验结果从而确定响应面试验的因素和水平区间，进行响应面试验设计与分析，以确定固定化单宁酶的最佳工艺条件。选取酶质量浓度、戊二醛质量分数和pH值3 个因素进行响应面试验设计，因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and their levels used in response surface analysis

1.3.5 固定化前后酶的表征

1.3.5.1 SEM分析

将干燥的固定化前后单宁酶及载体单宁微球样品均匀地撒在贴有双面导电胶的座上，将未黏上的粉末用洗耳球吹去，再喷金处理后放入电镜样品室，调节观察倍数并选择最佳视野进行拍照观察[21]。

1.3.5.2 FTIR分析

采用将游离单宁酶和固定化单宁酶分别置于干燥器内充分干燥，取0.05 g样品与KBr粉末0.5 g一起放入玛瑙研钵内，混合研磨，烘干10 min后压片，用Spetrum 100 FTIR仪在4 000～400 cm-1、分辨率为4 cm-1、波数精度为0.01 cm-1，环境温度为25 ℃，经32 次扫描测定样品FTIR图[22]。

1.3.6 蓝靛果果汁的制备

将蓝靛果解冻、漂烫，破碎搅拌，将得到的蓝靛果果浆离心（4 000 r/min，15 min），滤液过滤后灭菌将所得原汁放入冰箱4 ℃保存备用。

1.3.7 蓝靛果果汁中鞣花酸含量的测定

1.3.7.1 标准曲线的绘制

参考陈笳鸿等[23]方法测定鞣花酸的含量。称取10 mg鞣花酸标准品，缓慢加入0.1 mol/L NaOH溶液共3.5 mL，定容至100 mL。分别从稀释液中取1、5、10、15、20 mL至100 mL容量瓶中，定容，配成质量浓度分别为1、5、10、15、20 mg/L的溶液，以蒸馏水为空白，测定其在357 nm波长处的吸光度。

1.3.7.2 鞣花酸含量的测定

取1 mL样液加入3.5 mL的0.1 mol/L NaOH溶液，常温下反应15 min（颜色由浅黄色变为深棕色）后，在357 nm波长处测定其吸光度，以蒸馏水为空白测定，所有测试都进行3 个重复。根据标准曲线求出样液中所含有的鞣花酸含量。

1.3.7.3 固定化酶在蓝靛果果汁中的水解

于50 mL蓝靛果果汁中加入0.2 g固定化单宁酶（121 U），分别在50 ℃和40 ℃条件下100 r/min振荡反应1 h后，过滤，取样进行鞣花酸含量的测定，以未加酶的蓝靛果汁为对照组。比较鞣花酸含量的高低，评价固定化酶在蓝靛果果汁中水解后提高鞣花酸含量的能力。

1.3.8 猪舌膜染色的检测

1.3.8.1 原料处理

选用4 条大小一致、表面膜完整的新鲜猪舌头，洗净后沿舌根向舌尖切取表面黏膜，其下层肉全部切除，处理完成后将黏膜均切成形状一致的小块，放入盛有0.9%生理盐水和微量叠氮化钠的烧杯中，再在4 ℃冰箱中封膜保存备用。

1.3.8.2 人工唾液的配制

分别加入0.78 g磷酸氢二钠、0.795 g氯化钙、0.005 g硫化钠、1 g尿素、0.4 g氯化钠和0.4 g氯化钾，用蒸馏水定容至1 L，然后用NaOH溶液调pH值为6.8即配制完成[24]。

1.3.8.3 染色实验

取处理后的猪舌头表皮黏膜，放入盛有人工唾液的烧杯中浸泡30 min，然后在25 mL蓝靛果果汁中加入4 mg固定化单宁酶，再用NaOH溶液调pH值为4.5后，将沾有唾液的猪舌黏膜完全浸入其中，室温下染色5 min后放入人工唾液中30 min，观察着色能力。

1.3.8.4 色差分析

取染色完成后的猪舌黏膜样品采用CS-800型分光测色仪进行测定。首先使用黑板和白板分别校准色差仪，再直接将样品置于光源上进行测量，读取仪器显示的数值（ΔL*、Δa*、Δb*和ΔE*ab），其中ΔL*值为所测样品与标准白板间的亮度（L*）差，ΔL值越大亮度越高；Δa*值为所测样品与标准白板间的a*值差，＋Δa*为红度加强，-Δa*为绿度加强；Δb*值为所测样品与标准白板间的b*值差，＋Δb*为黄度增加，-Δb*为蓝度增加；ΔE*ab为色差，表示为所测样品的L*、a*、b*值与标准白板间的色差值[25]。以此确定其颜色的色调和明亮度，对染色效果进行分析。

1.3.8.5 固定化酶添加量对色差的影响

在25 mL蓝靛果果汁中分别加入1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mg的固定化单宁酶，并按1.3.8.3节方法进行处理。以未加酶果汁的染色为对照，分别测定ΔL*、Δa*、Δb*和ΔE*ab值。

1.3.8.6 显微镜分析

将猪舌黏膜在加有固定化酶的果汁中按条件进行染色，然后在40 倍显微镜下观察猪舌黏膜表面的染色现象，与未加固定化单宁酶的果汁染色相比较研究其着色能力。

1.4 数据统计分析

将得到的数据进行3 次重复的平均值，采取SPSS 13.0数据统计分析进行方差分析，响应面所得数据使用Design-Expert 7.0.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶质量浓度对固定化酶活力的影响

图1 酶质量浓度对固定化酶活力的影响Fig. 1 Effects of tannase concentration on the activity of immobilized enzyme

由图1可知，酶质量浓度为0.03 mg/mL时，固定化酶的活力回收率最大；当酶质量浓度低于0.03 mg/mL时，所制备的单宁微球表面能够吸附住大部分单宁酶，从而使得酶固定化活力回收率随酶质量浓度的增加而提高；但当酶质量浓度大于0.03 mg/mL后，达到一定的酶质量浓度时载体的负载量已到达饱和状态，相反会由于空间位阻等一些因素，最终导致固定化酶活力回收率降低。

2.1.2 戊二醛质量分数对固定化酶活力的影响

单宁通过改性成为单宁微球后与戊二醛发生交联反应，引入醛基官能团，其可与单宁酶发生Schiff反应，连接酶与载体以此实现游离酶的固定化[26-28]。

图2 戊二醛质量分数对固定化酶活力的影响Fig. 2 Effects of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme

由图2可知，戊二醛质量分数对单宁酶活力有一定的影响。当戊二醛质量分数小于0.1%时，固定化酶的活力回收率随其质量分数的升高而增大；当戊二醛质量分数为0.1%时，固定化酶活力回收率达到最大值；当戊二醛质量分数在0.1%～0.3%范围内，固定化酶活力回收率随戊二醛质量分数的升高而逐渐降低，这是由于戊二醛质量分数很小时易造成酶的流失，但当质量分数过大时，会造成与酶蛋白交联过度以此改变活性中心，同时也会限制酶与底物之间的接触和扩散，并能较大程度地影响酶活力。

2.1.3 pH值对固定化酶活力的影响

图3 pH值对固定化酶活力的影响Fig. 3 Effects of pH on the activity of immobilized enzyme

在固定化酶的过程中，pH值的变化会引起酶的微观结构改变。由图3可知，当pH值为3.5～6.5时，固定化酶的活力回收率呈上升趋势；当pH值为6.5时，酶活力回收率最高；pH值为6.5～8.5时，酶活力回收率呈下降趋势，这可能是因为当溶液的pH值超过一定范围时，单宁酶分子的结构特性产生了改变，从而导致酶变性，活力下降。这表明单宁酶的固定化受pH值影响程度大。这可能是因为固定化的介质其酸碱性在酶结构上受到的影响是根据酶的净电荷由介质的等电点所决定的。载体的性质受到影响是由于其能够改变其带电荷量；酶的微观结构特征的变化会造成酶特性的改变，从而使酶失去活力[29]。

2.1.4 固定化时间对固定化酶活力的影响

图4 固定化时间对固定化酶活力的影响Fig. 4 Effects of immobilization time on the activity of immobilized enzyme

由图4可知，随着固定化时间的延长，固定化酶活力回收率逐渐上升，当达到40 min时酶活力回收率最大，40 min后固定化酶活力回收率趋于稳定状态。这一现象可能是由于交联时间过短会影响反应的完成程度，随着固定化时间延长，载体交联越紧密，固定化效果逐渐提升；且一定质量的载体对固定酶要有一定的时间，但被载体所吸附的单宁酶量已到达饱和状态时就不能吸附多余的酶[30]，所以酶活力也就保持相对的稳定状态。因此，选取固定化时间40 min为最佳。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型的建立及显着性检验

通过Design-Expert 7.0.0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到酶活力回收率对酶质量浓度（A）、戊二醛质量分数（B）和pH值（C）的二次多项回归方程：Y=70.87-1.23A＋0.12B-0.37C-0.17AB＋0.41AC-0.092BC-2.33A2-3.56B2-3.01C2。根据试验结果进行方差分析，见表3。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental scheme and results of central composite design

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知，模型的R2值为0.999 8，表明精简模型可用于解释约99.98%的试验数据，其与实际情况拟合度良好。整体模型F值为2 315.99，P值小于0.000 1，二次方程模型极显着。方程的一次项中A、B、C对响应值Y（酶活力回收率）的影响极显着（P＜0.01），二次项A2、B2、C2对Y的影响极显着（P＜0.01），交互项AB、AC对响应值Y的影响极显着（P＜0.01），BC对Y的影响显着（P＜0.05）。

2.2.2 因素间的交互影响

图5 酶质量浓度、戊二醛质量分数与pH值交互作用的响应面和等高线图Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of tannase concentration, glutaraldehyde concentration and pH on the recovery of enzyme activity

图5综合反映了各变量与响应值之间、变量与变量之间的关系。根据表3可知，各影响因素对酶活力回收率的影响均不是简单的线性关系。且从等高线图可知其交互能力的强弱，椭圆形说明两个因素间交互程度显着，而圆形则不显着。酶质量浓度与戊二醛质量分数的交互作用较显着，而其他因素间的交互作用较小。根据回归模型通过Design-Expert软件分析得出最佳工艺参数为酶质量浓度0.03 mg/mL、戊二醛质量分数0.10%、pH 5.42，酶活力回收率预测值为71.05%。

2.2.3 验证实验结果

优化响应面分析得到的最佳条件为酶质量浓度0.03 mg/mL、戊二醛质量分数0.10%、pH 5.4，在此条件下进行验证实验，酶活力回收率实测值为71.78%，与预测值相对误差为1.02%，而此时酶的比活力为724.72 U/mg。表明模型与实际实验结果相符，该结果可适用于单宁微球固定化单宁酶的工艺条件。

2.3 酶固定化前后的表征结果

2.3.1 SEM结果

图6 固定化前后单宁酶SEM图Fig. 6 SEM images of tannase before and after immobilization

由图6可知，固定化前单宁酶经分离纯化后的球形结构较为规整、表面较致密光滑，粒径分布较均匀；制备的单宁微球为杆状结构，形状不规则、组织致密，表面较粗糙；经单宁微球固定的单宁酶由最初的致密转为疏松，表面比较粗糙，结构由球形变为杆和球的交联状态，且其表面含有部分的絮状物，这可能由于单宁微球有较强的结合能力，结合过程中高分子链受单宁酶的络合作用重新聚集的结果。

2.3.2 FTIR结果

单宁酶及单宁微球有不同基团，红外吸收因而具有差异，固定化单宁酶是游离单宁酶和单宁微球的结合，红外吸收具有相同的特性，三者FTIR如图7所示。

游离单宁酶的FTIR图谱中在3 437 cm-1处出现较强的吸收，是单宁酶上有氨基伸缩振动引起的吸收峰，2 923 cm-1处的吸收峰为亚甲基的伸缩振动峰，1 630 cm-1处吸收峰为C—O的伸缩振动峰。而归属分子间氢键O—H的伸缩振动吸收峰由单宁微球的3 458 cm-1略低移至固定化单宁酶的3 456 cm-1，且固定化单宁酶在此的峰变强变宽，说明分子间含有较强的氢键。在单宁微球和固定化单宁酶上均出现了单宁酶在2 923 cm-1处的特征吸收峰，表明吸收峰的细微变化是可信的。同时，单宁微球和固定化单宁酶都在1 694 cm-1处出现羧酸的C=O伸缩振动峰，在1 523 cm-1处的吸收峰为C=C伸缩振动峰；单宁微球在1 620 cm-1处因与戊二醛发生交联反应生成Schiff碱使C=N伸缩振动得以加强，而在固定化单宁酶中，由于单宁酶中的氨基与戊二醛中的一个醛基发生反应，所有在1 621 cm-1处的吸收峰减弱，这都表明单宁酶很好地固定在单宁微球上。而1 630 cm-1处的吸收峰没有在固定化酶中出现，可能是由于该峰是粗单宁酶杂质的吸收峰，并没有被单宁微球载体所吸附，故固定化单宁酶上没有出现相应的吸收峰。

图7 单宁微球、单宁酶和固定化单宁酶的FTIRFig. 7 FTIR spectra of tannin microspheres, tannase and immobilized tannase

2.4 鞣花酸标准曲线的绘制

鞣花酸质量浓度与其357 nm波长下的吸光度成正比，随着鞣花酸质量浓度的升高，其吸光度也逐渐升高。其线性回归方程为y=0.024x＋0.036 6，R2=0.993 7。其中，x为所测溶液中鞣花酸质量浓度/（mg/L），y为所测定的吸光度A。

2.5 固定化酶在蓝靛果果汁中的水解

表4 酶在蓝靛果果汁中水解后鞣花酸含量的变化Table 4 Changes in ellagic acid content after enzymatic hydrolysis of Lonicera edulis juice

由表4可知，在蓝靛果果汁中分别添加游离单宁酶和固定化单宁酶水解后，果汁中鞣花酸质量分数分别明显提高了5.57%和29.12%，这表明果汁中加入单宁酶后水解转化成鞣花酸这一过程成功，能有效增加鞣花酸的含量，且固定化酶的水解程度明显高于游离酶，所以根据固定化酶的水解能力、稳定性、贮藏性和重复使用性等性质可完全替代游离酶在果汁饮料等工业生产中进行使用。

2.6 固定化酶添加量对色差的影响

表5 固定化酶添加量对色差的影响Table 5 Effect of immobilized tannase dosage on color difference

由表5可知，随着固定化酶添加量的增加，ΔE*ab值逐渐降低，表明色差下降。当固定化酶添加量小于4 mg时，ΔL*、Δa*、Δb*三个值表明整体果汁偏亮深红色，ΔE*ab值大于3.83；当固定化酶添加量为4 mg时，果汁颜色偏亮深红蓝色，ΔE*ab值为3.49，与原果汁色差值相差较大；当添加量为4.5 mg时，果汁颜色偏亮红色，且ΔE*ab值不变。根据色差值的变化说明了较原果汁相比，固定化酶的添加对颜色变化起到一定的作用。

2.7 显微镜分析

图8 猪舌黏膜染色前后显微镜图Fig. 8 SEM images of tongue mucous membrane before and after staining with L. edulis juice with immobilized tannase added

由图8所示，猪舌黏膜经染色前后变化明显，实际上经过原果汁染色后与再经人工唾液浸泡后（图8C）一样，没有明显变化，所以原果汁对猪舌黏膜的着色能力强，色素几乎完全沉着在舌头表层黏膜上。而经过加入固定化单宁酶的蓝靛果果汁染色（图8B）后，对猪舌黏膜的着色现象明显低于图8C的着色现象，这说明固定化酶的添加对舌头黏膜的着色能力大为降低。加入固定化酶的果汁染色后再经唾液浸泡（图8D）后，其颜色较图8B明显变浅，较8C图颜色相差巨大，与8A图相比颜色仅较深些，这是因为加有固定化酶的果汁使果汁中的单宁水解为鞣花酸，提高水解能力从而降低着色能力，且此果汁经唾液的浸泡或浸入，使得色素、沉淀被从猪舌表层黏膜上脱落下溶解到唾液中，从而对舌头黏膜的着色现象有所减弱。

3 结 论

以单宁微球为固定化酶载体，固定化单宁酶的研究，得到的单宁酶固定化最佳工艺条件为酶质量浓度0.03 mg/mL、戊二醛质量分数0.10%、pH 5.4、固定化时间40 min，此条件下的酶活力回收率为71.78%，比活力为724.72 U/mg；SEM显示游离酶球形结构表面较致密光滑，单宁微球为杆状结构，表面较粗糙，而酶固定化后结构疏松，表面较粗糙，结构由球形变为杆和球的交联状态，表明酶已固定到载体上；FTIR图谱显示单宁酶很好地固定在单宁微球上。

此外，通过对固定化酶在蓝靛果果汁水解中应用的研究表明，在果汁中添加固定化单宁酶水解后，果汁中鞣花酸含量明显提高了29.12%。固定化酶添加量为4 mg时ΔE*ab值为3.49；着色能力明显减弱。显微镜观察表明经过固定化酶处理后的果汁能明显降低对舌头黏膜的着色能力。