曾 颖，余 垒，朱新儒，李 雄，张海德*
（海南大学食品学院，海南 海口 570228）
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜（Carica papaya）的根、茎、叶和果实内，其在未成熟的果实中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于含巯基（—SH）肽链内切酶，具有酶活力高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品[1]、医药[2]、饲料[3]、日化[4]、皮革[5]及纺织[6]等行业得到了广泛应用，在食品及饮料工业上有独特的广阔发展前途[7]。木瓜蛋白酶具有蛋白酶和酯酶的活性，在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
对于木瓜蛋白酶分离提取的方法，主要有亲和层析分离法、超滤膜分离法、沉淀分离法、萃取分离法以及絮凝法等[8]，这些方法分别都存在一些局限性，有些对酶的稳定性存在不利的影响[9]。近年来，木瓜蛋白酶的提取分离方法及其应用又有了较大的进展[10]。例如王丽彬等[11]运用盐析及柱层析的方法获得了比活力为1 184 U/mg的木瓜蛋白酶，万婧等[12]采用有机溶剂法分离纯化木瓜蛋白酶。王田林等[13]优化超滤法对木瓜蛋白酶的纯化，得到的酶活力为（9.31±0.27）×104U/mg。这些传统分离方法工艺较为复杂，而且具有耗费时间及成本、产品酶活力不稳定等缺点，很难进行工业化生产，不能达到现代工业的要求。
双水相萃取技术是近年来出现的一种极有前途的新型分离技术，具有条件温和、操作简便和分离效率高等特点。与传统的有机溶剂萃取相比，双水相体系能够为生物活性物质提供一种温和的环境，而使其不易失活[14]。因此双水相萃取技术已广泛应用于生物活性物质的分离和纯化，如大多数酶和蛋白质等都能用双水相体系进行分离纯化[15]。传统的双水相体系主要类型有高聚物/高聚物、高聚物/无机盐、亲水有机物/盐体系，近年来出现了离子液体/盐双水相体系[16]。与传统双水相比较，溶液酸度范围较宽、不易乳化、界面更清晰、离子液体经简单处理可重复再利用[17]。2003年，Gutowski等[18]采用亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑盐酸盐（[Bmim]Cl）和磷酸钾（K3PO4）首次形成了离子液体/盐双水相体系。离子液体双水相结合了离子液体和传统双水相的优势，迅速发展并在分离生物活性物质[19-20]方面被广泛研究。
用双水相分离纯化木瓜蛋白酶已有一些初步的研究，但主要集中在聚乙二醇和盐组成的双水相系统上。盐析法具有应用成熟、操作便捷的优点。本研究结合盐析法和离子液体双水相萃取技术对番木瓜中的木瓜蛋白酶进行分离纯化，旨在从方法上寻求新的突破，为木瓜蛋白酶的纯化提供更多技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
番木瓜 海南；木瓜蛋白酶（生物纯） 生工生物工程（上海）股份有限公司；[C2mim]N(CN)2、[C4mim]N(CN)2、[C6mim]N(CN)2、[C8mim]N(CN)2兰州雨陆精细化工有限公司；(NH4)2SO4、NaOH（均为分析纯） 广州化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
TU1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用有限责任公司；DK-98-1型恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂；Alpha 1-2 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司；HJ-5型多功能恒温搅拌器 常州华奥仪器制造有限公司；GL-20G-II离心机 上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质量分数及木瓜蛋白酶活力测定
以牛血清白蛋白为标准品，用Bradford法[21]测定蛋白质量分数。以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶活力[22]。总酶活力、酶活力回收率、相对酶活力以及纯化倍数的计算见式（1）～（4）：
式中：EA为加入体系的总酶活力/U；SA为酶的比活力/（U/mg）；m为酶的质量/mg。AR为酶活力回收率/%；EAT为上相的酶活力/（U/mL）；VT为上相体积/mL。EAsolv为试剂存在时酶活力/（U/mL）；EAwater为空白对照的酶活力/（U/mL）；PF为纯化倍数；SAi为初始酶的比活力/（U/mg）。
1.3.2 盐析法制取粗木瓜蛋白酶
在未成熟的新鲜木瓜上纵向均匀划若干个切口，收集果汁，按体积比1∶1加入含0.2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L NaCl和0.04 mol/L Cys的缓冲液，离心去杂后获得粗酶液。取一定量的粗酶液，冰水浴中缓缓加入(NH4)2SO4粉末至一定饱和度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）。4℃、10 000×g离心10 min后，取上清液和沉淀测定酶活力和蛋白质含量，确定沉淀所用的最佳饱和度。将分级盐析后的沉淀溶解在缓冲液中，4 ℃透析6 h，全程磁力搅拌，若出现沉淀，则将其低温离心，取上清液真空冷冻干燥以备进一步分析。
1.3.3 相图的绘制
在295.15 K的条件下采用浊点法制作双节线[23]。分别配制60%的[C2mim]N(CN)2、[C4mim]N(CN)2、[C6mim]N(CN)2、[C8mim]N(CN)2离子液体溶液于大试管中，逐滴加入一定浓度的(NH4)2SO4溶液，直到溶液刚好变浑浊，记下消耗的盐溶液体积。再加入重蒸水使溶液澄清，重复上述操作到离子液体质量分数为5%左右停止操作。计算在溶液浑浊时离子液体和盐的质量分数，以(NH4)2SO4质量分数为横坐标、离子液体质量分数为纵坐标绘制相图。
1.3.4 木瓜蛋白酶的双水相萃取
以相图为指导，选取适当的点配制双水相体系。取真空冷冻干燥的酶作为双水相萃取的材料，待分相后，读取上下相体积并分别测定上下相蛋白质量浓度。考虑离子液体质量分数、(NH4)2SO4质量分数和pH值对分配系数（K）和萃取率（Y）的影响进行单因素试验，其计算公式见式（5）～（7）：
式中：R为相体积比；VT和VB分别为上、下相体积/mL；cT和cB分别为双水相体系中上下相的蛋白酶质量浓度/（mg/mL）。
根据单因素试验结果，选取离子液体质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值这3 个影响较为显着的因素，用Design-Expert 8.0.5软件设计3因素3水平的响应面试验，因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface methodology
1.3.5 木瓜蛋白酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）
采用电泳仪进行不连续双垂直板SDS-PAGE。将木瓜蛋白酶与样品缓冲液（pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液1.0 mL、甘油2.0 mL、10% SDS 1.0 mL、质量分数0.1%溴酚蓝1 mL、去离子水5 mL）按一定比例混合使蛋白质量浓度在10 μg/μL左右，100 ℃水浴3 min，离心，上样量10 μL，分离胶12.5%，浓缩胶4.5%。开始电压60 V，进入分离胶后100 V，电泳时间2.5～3.5 h。考马斯亮蓝R-250染液染色30 min，放入脱色液中摇床脱色，直至胶片背景蓝色变为完全透明。
1.4 数据处理与图形绘制
响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.5进行分析，P＜0.05，表示具有显着性差异。图形采用Origin 9.0软件绘制。
2 结果与分析
2.1 (NH4)2SO4分级沉淀鲜木瓜汁中的蛋白酶结果
图1 盐析后上清液酶活力及蛋白质含量变化曲线Fig. 1 Salting-out curve of the crude enzyme
由图1可知，当(NH4)2SO4饱和度为10%时木瓜蛋白酶相对酶活力变化不明显，但蛋白含量有所下降，说明部分杂蛋白沉淀下来。随着(NH4)2SO4饱和度的不断增加，当(NH4)2SO4饱和度继续增加到40%以上时，上清液中的酶活力已经很低，说明大部分木瓜蛋白酶从可溶性状态转变为沉淀析出。(NH4)2SO4饱和度到50%时，还有一些杂蛋白也随之析出。综合以上情况，采取两级盐析分离木瓜蛋白酶，分别选取饱和度为20%和45%
的(NH4)2SO4为其分级沉淀的一级和二级饱和度。先在粗酶液中缓缓加入(NH4)2SO4粉末至终饱和度为20%，离心弃沉淀。再继续加(NH4)2SO4粉末至终饱和度为45%，离心收集沉淀。
2.2 离子液体双水相相图分析
图2 295.15 K时[Cnmim]N(CN)2 (n= 2,4,6,8)-(NH4)2SO4双水相体系相图Fig. 2 Phase diagram of [Cnmim]N(CN)2 (n=2,4,6,8)-(NH4)2SO4 systems at 295.15 K
在温度为295.15 K条件下测定[Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4体系（n=2、4、6、8）的双节线，结果如图2所示。从图2可以看出，离子液体与盐的成相能力强弱为[C8mim]N(CN)2＞[C6mim]N(CN)2＞[C4mim]N(CN)2＞[C2mim]N(CN)2，离子液体阳离子侧链烷基越长，则离子液体疏水性越强，更容易形成双水相[24]。
为获得成相剂对成相的影响规律，并用Merchuk[25]方程对数据进行关联，见公式（8）：
式中：wIL、ws分别表示离子液体和(NH4)2SO4质量分数/%；a、b、c为方程参数。
由表2可以看出双节线数据的关联效果非常好。
表2 295.15 K时[Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4双节线关联结果Table 2 Bimodal correlation of [Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4 system at 295.15 K
2.3 离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶
由图1可知，在(NH4)2SO4溶液中，木瓜蛋白酶活力与木瓜蛋白酶含量具有较好的相关性。在一定浓度成相剂组成的离子液体双水相系统中，木瓜蛋白酶活力与木瓜蛋白酶含量也具有正相关性。王伟涛等[26]的实验表明咪唑类离子液体在35%以下没有明显的抑制作用。蔡涛等[27]的实验中咪唑类离子液体木瓜蛋白酶活力具有促进作用，在50%以内的离子液体可保持酶的相对活力在90%以上。所以为简化试验数据的测定，采用酶在咪唑类离子液体双水相中的分配系数和萃取率作为试验的响应值。
2.3.1 离子液体的选择
以相图为指导，用4 种离子液体配制相同质量组成的双水相，加入等量适量的酶液，木瓜蛋白酶的分配系数（K）以及萃取率的结果如图3所示。烷基侧链的增长有利于酶从下相转移到上相，但是侧链过长疏水性增加反而导致萃取率下降[28]，[C4mim]N(CN)2的萃取率最高，因此选取[C4mim]N(CN)2进行单因素试验优化双水相萃取条件。
图3 离子液体烷基侧链变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig. 3 Effect of alkyl chain length of ionic liquid on the partition behavior
2.3.2 离子液体质量分数的影响
保持盐的质量分数为15%不变，改变双水相中离子液体的质量分数，由图4可知，离子液体质量分数小于30%时，随着用量的增加，K值和萃取率逐渐增大，大于30%时，离子液体浓度过高，体积排阻效应增大导致木瓜蛋白酶在两相之间的传递和在上相中的扩散阻力大大增加，不利于蛋白质进入离子液体相，萃取率明显降低[29]。因此，选取离子液体[C4mim]N(CN)2质量分数为30%。
图4 [C4mim]N(CN)2质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig. 4 Effect of [C4mim]N(CN)2 concentration on the partition behavior
2.3.3 (NH4)2SO4质量分数的影响
固定[C4mim]N(CN)2质量分数为30%，加入等量适量的酶液，(NH4)2SO4质量分数对木瓜蛋白酶的分配行为影响见图5。由于盐析作用，盐的质量分数增加会提高萃取率[30]。当盐浓度过大时会使两相中的分子间相互作用力都变得很大，导致酶集中在两相之间，萃取率大大下降。所以最适盐质量分数为15%。
图5 (NH4)2SO4质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig. 5 Effects of (NH4)2SO4 concentration on the partition behavior
2.3.4 pH值的影响
图6 pH值对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig. 6 Effect of pH on the partition behavior
本实验中所考察的pH值对体系的影响范围为5.0～11.0，蛋白质的带电状态受pH值和等电点的影响，木瓜蛋白酶的等电点是8.78，在等电点及附近，离子液体与蛋白质之间主要靠氢键作用。从图6可知，当溶液pH值在一定范围内小于等电点时，更多蛋白质容易被萃取到离子液体相，这可能是因为此时带电的蛋白质与离子液体的阴阳离子发生了静电作用[31]。
2.4 响应面优化试验结果
根据Box-Behnken试验设计原理及单因素试验结果，选取[C4mim]N(CN)2质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值这3个影响较为显着的因素，采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计。
表3 响应面试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of RSM
表4 回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the established regression model and significance test
利用Design-Expert 8.0.5软件对表3试验结果进行二次多项回归拟合，得到响应值得回归方程：Y=89.4－0.375A+1.5B+1.125C－1.5AB+0.75AC－9.075A2－1.825B2－3.075C2。各项回归系数及其显着性检验结果见表4。回归方程中各个变量对响应值影响的显着性由F值检验，P值越小，则相应变量的显着程度越高。回归模型P值为0.009 8，说明模型极显着，A2影响极显着，说明对萃取率影响较大。
各因素的交互影响见图7，说明了3 个交互项对响应值影响并不显着。模型的相关系数R2值为0.896 8，说明响应值的变化有89.68%来源于所选变量。因此，回归方程可以比较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以用来确定最佳提取条件[32]。通过Design-Expert 8.0.5软件进行系统分析，得出[C4mim]N(CN)2-(NH4)2SO4系统萃取木瓜蛋白酶的最佳条件为[C4mim]N(CN)2质量分数29.76%、(NH4)2SO4质量分数16.08%、pH 8.18，在此条件下通过回归方程计算得出萃取率为89.83%。按照优化条件进行平行验证实验，得萃取率平均值为89.01%，与预测值89.83%比较可知，响应面分析所得的模型是可靠的。
图7 各因素两两交互作用影响萃取率的响应面图Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on extraction efficiency
2.5 木瓜蛋白酶纯化结果
2.5.1 纯化过程各步骤酶活力分析
分别测定木瓜蛋白酶在本实验各纯化步骤后的比活力，结果如表5所示。木瓜乳汁经离心和冷冻干燥制得的粗酶比活力为110 U/mg，再经过盐析得到的木瓜蛋白酶比活力为348 U/mg。再利用响应面试验分析所得的最优离子液体双水相对酶进行纯化，得到了比活力为1 056 U/mg的木瓜蛋白酶。从木瓜乳汁中提取的粗酶，经过盐析纯化后，纯化倍数为3.16，再经过离子液体双水相萃取后，纯化倍数达到9.6 倍。在离子液体双水相纯化过程中，在优化条件下，酶活力回收率可达86.72%。
表5 木瓜蛋白酶在纯化过程中的酶活力比较Table 5 Summary of purification steps of papain
2.5.2 SDS-PAGE分析
经过盐析以及在最佳双水相条件下提取的木瓜蛋白酶，通过SDS-PAGE分析，取得了较好的分离效果。从图8可以看出，购买的木瓜蛋白酶纯度较高（条带1），符合木瓜蛋白酶标准分子质量（23 kDa）木瓜乳汁经离心冷冻干燥后所得样品中（条带2），木瓜蛋白酶的纯度比较小，而且还含有许多小分子杂质；盐析过后杂质相对减少，木瓜蛋白酶含量增大；再经双水相萃取后，木瓜蛋白酶纯化效果较好。
图8 木瓜蛋白酶的SDS-PAGE图Fig. 8 SDS-PAGE Electrophoretograms of crude and purified papain
3 结 论
本研究先用不同饱和度的(NH4)2SO4对木瓜蛋白酶的粗酶液进行盐析，然后再通过离子液体双水相对木瓜蛋白酶进一步分离纯化。木瓜乳汁经离心和冷冻干燥制得的粗酶比活力为110 U/mg，再经过盐析得到的木瓜蛋白酶比活力为348 U/mg，最后通过离子液体双水相对酶进行纯化，得到比活力为1 056 U/mg的木瓜蛋白酶。实验结果表明，对木瓜蛋白酶进行盐析的最佳条件是用饱和度为20%和45%的(NH4)2SO4进行两级盐析，再利用响应面试验得出双水相萃取的最优条件为[C4mim]N(CN)2质量分数29.76%、(NH4)2SO4质量分数16.08%、pH 8.18，在此最优条件下，木瓜蛋白酶的纯化倍数达到9.6 倍，萃取率为89.01%，酶活力回收率为86.72%。相较于传统的亲和层析、沉淀和超滤等方法，本实验所采取的纯化方法大大缩短了时间成本，在提高萃取效率的同时降低了酶活力的损耗。最后通过SDS-PAGE对实验结果进行分析，证明了盐析法联合离子液体双水相纯化木瓜蛋白酶的效果非常好，为进一步的深入研究提供了参考和研究方向。
