朱俊亚，李 芳,2,*，赵兰馨，李席席，刘云宏,2
（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳 471023）
氨苄青霉素（ampicillin，AMP），又称氨苄莫林，是一种β-内酰胺类抗生素，因其耐酸耐霉、杀菌活性强、毒性低及广谱廉价等优点，广泛应用于奶牛养殖产业中[1]。经常食用AMP残留奶制品会增强机体耐药性，造成肝肾功能损害，严重的还会影响机体耐药基因的传递和患病医学治疗[2-3]。为保障人体健康，许多国家和地区都对AMP在牛奶中的最大残留量进行了规定：欧盟标准为4 μg/kg（约1.0×10-8mol/L）[4]，美国标准为10 μg/kg（约2.5×10-8mol/L）[5]，我国农业部最新修订颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》标准为10 μg/kg（约2.5×10-8mol/L）。国内外对牛奶中AMP最大残留量的强制规定推动了AMP检测方法的发展与创新。目前，常用的AMP检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、液相-质谱联用法等[6]，这些方法存在过程繁琐、仪器昂贵和操作复杂等缺点。近年来，免疫分析（immunoassay，IAs）法应用日趋广泛，但由于AMP是小分子化合物，存在抗体质量不稳定、方法特异性差等问题，限制了IAs法的普及[7]。适配体克服了传统抗体的缺点，具有筛选周期短、合成批次间差异小、亲和性和特异性高等特点[8-9]，为小分子化合物检测提供了一种可替代的识别元件。以适配体作为识别元件的传感检测技术开始崭露头角[10]。曾宪冬等[11]利用核酸适配体-金纳米颗粒比色传感技术实现了对赭曲霉毒素A的快速、高效检测。Ma Qiang等[12]利用金纳米颗粒和单链DNA构建比色适配体传感器，实现了牛奶和鸡蛋中妥布霉素的有效检测。已报道的适配体传感检测技术多采用金纳米显色技术[13-15]、荧光光谱分析[16-18]，对于将纳米磁磁与电化学技术相结合运用于食品中AMP检测的报道甚少，仍有待深入研究。
本研究以AMP为研究对象，选择纳米磁磁为载体，将两者共价偶联。在AMP-适配体特异性结合基础上，以偶联的AMP为识别探针，与待测样中的AMP共同竞争反应体系中的适配体和辣根过氧化物酶，并利用磁性玻碳电极将上述磁磁吸附于电极检测表面直接进行电化学测定，构建可用于牛奶中AMP高效检测的电化学适配体传感检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羧基纳米磁磁 英芮诚生化科技（上海）有限公司；AMP（≥98.89%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；AMP适配体（5’-biotin-GCG GGC GGT TGT ATA GCG G-3’）生工生物工程（上海）股份有限公司；链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase，SA-HRP） 北京博奥森生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
实验操作过程中所用溶液均为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）配制。
1.2 仪器与设备
TG16-WS型台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；KQ2200型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；BE-1100型四维旋转混合仪 海门市其林贝尔仪器有限公司；CHI620E型电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；HRCLJ-02型磁性分离架 河南惠尔纳米科技有限公司。
电化学检测使用三电极体系：磁性玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，购自武汉高仕睿联科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 实验原理
基于电化学适配体传感器检测牛奶中AMP的原理如图1所示。采用碳二亚胺交联法制备了修饰有AMP的磁磁（磁性识别探针），其可与适配体特异性结合构成磁性AMP-适配体复合物，由于所合成适配体的5’端修饰有生物素，因此当加入SA-HRP后，在链霉亲和素-生物素作用下，又可将HRP偶联到磁磁表面，随后便可利用磁性玻碳电极，将上述磁磁（磁性信号探针）磁吸固定于电极的检测表面[19]，在HQ、H2O2条件下进行电化学检测。该检测体系是以AMP-适配体竞争模式为基础进行的，当检测体系中存在游离的（待测）AMP时，会和磁磁表面修饰的AMP竞争与适配体结合的机会，形成较多的游离（待测）AMP-适配体复合物，导致磁性AMP-适配体复合物数量的减少，使得能够结合到磁磁表面的HRP数量也随之减少，故获得较低的电化学检测信号。相反，当检测环境中不存在游离的（待测）AMP时，则不存在上述竞争过程，因而可获得较高的电化学检测信号。该适配体传感器通过竞争前后显着的电化学信号变化实现对牛奶中AMP的有效检测。
图1 适配体传感器检测AMP原理图Fig. 1 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor for the detection of ampicillin based on competitive format
1.3.2 适配体传感器的构建
1.3.2.1 磁性AMP识别探针的制备
主要步骤参照文献[20]，采用碳二亚胺交联法制备磁性AMP识别探针。于1 mg羧基纳米磁磁中加入1 mL 15 mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）偶联液洗涤2 次。加入100 μL 15 mmol/L MES偶联液和100 μL EDC溶液重悬磁磁，室温条件下于四维旋转混合仪上避光活化。磁分离，用1 mL 15 mmol/L MES偶联液洗涤2 次。加入500 μL AMP溶液，室温条件下于四维旋转混合仪上避光孵育。产物用PBST（0.01 mol/L PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4）洗涤2 次，再加入1 mL PBS重悬，4 ℃贮存。
1.3.2.2 磁性AMP-适配体复合物的制备
磁分离去上清液，加入适量待测AMP和适配体溶液，混合均匀，室温条件下于四维旋转混合仪上避光孵育一段时间。产物用PBST洗涤3 次。
1.3.2.3 磁性信号探针的制备
方上述复合物中加入200 μL SA-HRP稀释液（1∶1 000），室温条件下于四维旋转混合仪上避光孵育一段时间。产物用PBST洗涤3 次，再加入200 μL PBS重悬，4 ℃贮存备用。
1.3.2.4 适配体传感器的组装
利用磁性玻碳电极具有的磁性吸附作用，将上述磁磁（磁性AMP信号探针）磁吸固定于磁性工作电极检测表面，用于后续电化学检测。
1.3.3 工作电极的预处理
工作电极选择磁性玻碳电极，依次用0.3、0.05 μm的抛光粉（Al2O3）打磨抛光至镜面，随后依次用超纯水、体积分数50%的乙醇溶液、超纯水超声清洗。最后置于0.5 mol/L H2SO4溶液中用循环伏发法活化，直至得到稳定的循环伏发曲线为止，处理后的电极用氮气吹干备用。
1.3.4 电化学检测
适配体传感器的电化学表征通过循环伏发法在含1 mmol/L K3[Fe(CN)6]和1 mmol/L K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中测定。循环伏发法检测参数如下：初始电位-0.1 V、终止电位0.6 V、扫描速率0.05 V/s、扫描圈数2、取样间隔0.001 V、静置时间2 s。
氧化电流通过线性扫描伏发法在含HQ、H2O2的PBS中测定。检测参数如下：初始电位0.1 V、终止电位-0.3 V、扫描速率0.1 V/s、取样间隔0.001 V、静置时间2 s。
1.3.5 特异性实验
参照实验步骤1.3.2节，分别加入1.0×10-8mol/L AMP和1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四环素、卡那霉素、红霉素进行特异性检验，检测条件同1.3.4节氧化电流检测方法所述。
1.3.6 实际样品处理
为验证本适配体传感器的实用性，采用标准加入法来检测牛奶中的AMP。参照文献[21]对市售牛奶进行预处理，首先以牛奶为本底配制一定浓度梯度的AMP牛奶样品，接着加入20%三氯乙酸溶液调节pH值至4.6，于45 ℃条件下沉淀15 min，然后在10 000 r/min离心25 min，最后将得到的上清液用0.22 μm滤膜过滤备用。
1.4 数据处理
实验数据均采集于CHI620E型电化学工作站，以各优化条件对AMP-适配体竞争反应发生前后适配体传感器净电流值ΔI的变化量为依据进行数据分析，公式如下：
ΔI＝I0-IX
式中：I0为适配体传感器在反应体系中不存在待测AMP参与竞争反应时所测电流值；IX为适配体传感器在反应体系中存在待测AMP参与竞争反应时所测电流值。
2 结果与分析
2.1 电极修饰表征
采用循环伏发法表征磁性AMP信号探针在电极表面的修饰。图2为不同电极在0.1 mol/L KCl+1 mmol/L溶液中的循环伏发曲线。如图2所示，曲线a为裸磁性玻碳电极的CV曲线，呈现明显的氧化还原特征，表现出可逆的氧化还原行为。曲线b为修饰了磁性AMP信号探针后的电极循环伏发曲线，在磁性作用下，所构成的磁性AMP信号探针被修饰到磁性玻碳电极的检测表面，形成一层不导电的绝缘核酸、蛋白层，阻碍了电子的传输，从而导致氧化还原电流值降低。此现象表明磁性AMP信号探针已成功固定到电极的表面上。
图2 磁性玻碳电极修饰磁性AMP信号探针前后电化学表征Fig. 2 Electrochemical signal of magnetic glass carbon electrode before and after capturing magnetic AMP signal probe
2.2 反应条件的优化
为提高适配体传感器的性能，同时达到节约成本、节省时间的目的，对磁性AMP-适配体复合物形成过程中的反应时间、反应pH值、检测过程中磁性信号探针的使用量、测试过程中底液H2O2及HQ浓度等进行优化。
2.2.1 反应时间的优化
为保证反应体系中的AMP充分竞争获得AMP适配体形成相应状态的AMP-适配体复合物，对反应时间为10、20、30、40、50 min和60 min的样品进行电化学分析，由图3可知，反应进行前30 min，净电流值随时间延长快速增加，于第30分钟处达到最大值，反应进行30 min后，净电流值随时间延长开始呈现缓慢下降趋势。这表明反应进行第30分钟时，游离的（待测）AMP可充分竞争获得反应体系中的适配体，形成较多的游离（待测）AMP-适配体复合物，那幺磁性AMP-适配体复合物的数量就会同步减少，影响磁性AMP信号探针形成量，从而获得较高的净电流值。因此，选定最优反应时间为30 min。
图3 反应时间对净电流的影响Fig. 3 Effect of reaction time on ΔI
2.2.2 反应pH值的优化
图4 反应pH值对净电流的影响Fig. 4 Effect of pH value on ΔI
测定不同pH值条件下样品的电化学信号，由图4可知，随着pH值的升高，适配体传感器检测的净电流值也在增加，在pH 8.0时净电流值最大。继续升高pH值时，净电流值反而急速下降。这表明pH值对不同状态AMP-适配体复合物的形成影响较大，当pH 8.0时，适配体结构中的活性结合位点增加[22]，有助于游离（待测）AMP-适配体复合物形成，产生较高的净电流值。而pH值过大或者过小都会影响适配体结构中结合位点的活性，导致游离（待测）AMP-适配体复合物数量的减少，产生较低的净电流值。因此，选定AMP-适配体竞争反应的最优pH值为8.0。
2.2.3 磁性信号探针使用量的优化
电化学检测过程中，适量磁性信号探针的使用可以提高适配体传感器的灵敏度，同时还能保证其不造成浪费。因此，需要对检测过程中磁性信号探针的使用量进行优化。实验中依次将10、30、50、100 μg和150 μg磁性信号探针磁吸固定于处理过的工作电极检测表面，通过电化学工作站对净电流值进行检测分析。由图5可知，随着磁性信号探针使用量的增加，净电流值快速增大，在50 μg处达到最大值。当继续增加磁性信号探针使用量时，净电流值反而呈现逐步下降趋势。这表明随着磁性信号探针使用量的增加，磁性电极表面的有效吸附区域正被逐步覆盖，在50 μg使用量时达到饱和，之后继续增加磁性信号使用量反而使探针相互堆积，电子传输速率受到影响，导致净电流值减弱。因此，磁性信号探针的最优使用量为50 μg。
图5 磁性信号探针使用量对净电流的影响Fig. 5 Effect of the amount of magnetic signal probe on ΔI
2.2.4 检测条件的优化
图6 检测体系中H2O2浓度对净电流的影响Fig. 6 Effect of H2O2 concentration on ΔI
图7 检测体系中HQ浓度对净电流的影响Fig. 7 Effect of HQ concentration on ΔI
检测H2O2浓度对净电流值的影响，如图6所示，H2O2浓度在0.5 mmol/L时，净电流值达到最大值，所以H2O2最优浓度为0.5 mmol/L。同时，以相同的实验方法，检测HQ浓度对净电流值的影响。如图7所示，HQ浓度在0.5 mmol/L时，净电流值最大，其余浓度条件下的净电流值虽有变化，但都远小于0.5 mmol/L时的净电流值。因此，HQ最优浓度为0.5 mmol/L。
2.3 AMP的定量检测结果
在最优实验条件下，采用本传感检测方法对不同AMP浓度梯度为的样品进行测定。如图8所示，其氧化电流值随着待测样品中AMP浓度的降低而升高。以样品浓度的对数为横坐标，竞争前后的净电流值为纵坐标作图，结果显示该适配体传感器在AMP含量为1.0×10-12～1.0×10-8mol/L的浓度梯度范围内存在良好的线性关系，线性回归方程为：ΔI/μA=2.239 8+0.171 9 lgCAMP，R2=0.995 4，检出限为1.0×10-12mol/L。该适配体传感器检测法与文献报道的AMP检测法相比，有较低的检测限和较宽的检测范围（表1）。此外，将制备好的适配体传感器置于4 ℃条件下避光保存，在最优实验条件下，每隔1 d对浓度为1.0×10-9mol/L的AMP进行电化学检测，以检测该适配体传感器的稳定性。在1.0×10-9mol/L AMP条件下，线性扫描伏发法测定结果的日内精密度为1.51%，日间精密度为3.30%。上述结果表明，放置一段时间的适配体传感器检测效果与最初制备的适配体传感器检测效果差异不大，具有良好的稳定性（7 d）。
图8 适配体传感器在不同AMP浓度下的线性扫描伏安法扫描图Fig. 8 Linear sweep voltammetry analysis of the aptasensor with different AMP concentrations
表1 本实验适配体传感器与其他检测方法比较Table 1 Comparison of the developed method with other detection methods
2.4 方法特异性
为验证该适配体传感器的特异性，排除实际样品检测中可能遇到的其他族类或结构类似抗生素的干扰，分别加入1.0×10-8mol/L AMP，1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四环素、卡那霉素和红霉素反应进行电化学信号测定。如图9所示，当检测体系中存在1.0×10-8mol/L的AMP时，净电流值明显最高，但是当检测体系中的AMP由1.0×10-6mol/L的其他抗生素替代时，净电流值都明显偏低。由此表明，本实验构建的适配体传感器对AMP具有较高的特异性。
图9 适配体传感器特异性分析Fig. 9 Specificity analysis of the aptasensor
2.5 牛奶样品检测结果
取购自超市的新鲜纯牛奶，按照1.3.6节方法进行预处理后，对其进行加标回回实验，加标回回率为95.24%～101.30%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）不大于4.38%（n=5）。结果表明：该电化学适配体传感检测方法准确可靠，可用于实际牛奶样品中AMP含量的测定（表2）。
表2 牛奶样品中AMP的检测结果Table 2 Recoveries and precision for ampicillin in spiked milk sample
3 结 论
以羧基纳米磁磁为载体，适配体与AMP特异性结合为基础，构建AMP电化学适配体传感器。采用碳二亚胺交联法制备了修饰有AMP的磁磁，并以其为磁性识别探针，与待测样中AMP共同竞争反应体系中的适配体和辣根过氧化物酶，随后利用磁性电极将上述磁磁（磁性信号探针）吸附于电极检测表面进行电化学测定。对影响适配体传感器性能的参数，如竞争反应时间和反应pH值、磁性信号探针使用量、测试底液中H2O2和HQ浓度等进行了优化。确定最佳竞争反应时间为30 min，反应pH值为8.0，磁性信号探针使用量为50 μg，测试底液中H2O2和HQ浓度均为0.5 mmol/L。在最佳条件下，该适配体传感器在AMP浓度为1.0×10-12～1.0×10-8mol/L梯度范围内存在良好的线性关系，检测限可达1.0×10-12mol/L，具有较低的检测限和较宽的检测范围。通过加标回回实验检测牛奶样品中的AMP，证明该适配体传感器可用于牛奶中AMP的高效检测。
