不同载体固定化蒙氏肠球菌发酵蛋壳制备乳酸钙

赵静丽，刘远远，马美湖

（华中农业大学食品科学技术学院，国家蛋品加工技术研发中心，湖北 武汉 430070）

我国是世界上蛋类生产最多的国家，蛋品加工产生的蛋壳量十分巨大[1]。每年大量废弃蛋壳在未经任何预处理的情况下被丢弃，残留的蛋清和其他物质容易引起微生物污染和严重的环境问题，并且造成资源浪费[2]。因此，提高蛋壳废弃物的利用价值已成为研究的热点。

蛋壳组成中约含有93%的碳酸钙，以及少量碳酸镁、磷酸钙等[3]。鸡蛋壳中含有丰富的钙，是一种天然的绿色钙源，可用作碳酸钙材料，形成不同的钙盐，如柠檬酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙[4]。而蛋壳乳酸钙与其他有机钙盐相比具有良好的溶解性和生物利用度[5-6]。目前蛋壳乳酸钙主要可以通过煅烧[7]、直接中和或发酵方法制成，与前两种方法相比，发酵方法具有绿色无污染且成本低的优势，符合我国的可持续发展方向[8]。然而，微生物发酵法制备乳酸钙产率低，这很大程度限制了蛋壳废物的有效利用。

为提高微生物发酵产乳酸钙的能力，实验室前期开展大量的菌种选育工作，从长期深埋废弃蛋壳的土壤中分离1 株具有较强产乳酸钙能力的菌株蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。为进一步提高乳酸钙产量，采用固定化细胞技术。固定化细胞技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的，常用于获得高密度细胞[9-11]，与传统发酵相比，固定化细胞发酵具有连续发酵的优势。在工业规模上，细胞固定可以有效地增加发酵罐中细胞浓度，改善细胞的操作稳定性，并减少下游处理[12-13]。选择合适的固定化载体对于固定化技术在实际生产中具有重要意义，目前常用的载体为海藻酸钠（sodium alginate，SA）， 由于其固定的微生物具有生物活性高、制备简单、对生物的毒性小等被广泛使用[14-15]，其形成凝胶的机理是SA中钠离子被氯化钙中钙离子置换形成海藻酸钙。但是，在实际应用中由于发酵液中存在磷酸盐体系，易使 钙离子脱落，从而导致载体破裂和细胞泄露，不利于其应用[16]。已有研究报道，藻酸盐凝胶可以通过添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）与戊醛交联反应或发酵液中的其他钙离子加强其机械稳定性[17]。

考虑到蛋壳废物的主要成分碳酸钙可有效提供钙离子，以解决SA-氯化钙体系中机械稳定性差的问题，采用SA、海藻酸钠-聚乙烯醇（sodium alginate-polyvinyl alcohol，SA-PVA）、海藻酸钠-活性炭（activated carbon，SA-C）作为包埋载体，通过比较其机械强度、传质系数、细胞操作稳定性等指标选择最适的包埋载体，并对最适包埋载体的性质进行研究，以期为固定化细胞技术有效利用蛋壳废物生产乳酸钙提供一定的理论基础，以实现工业连续发酵的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒙氏肠球菌CGMCC No. 8699由本实验室从长期深埋废弃蛋壳的土壤中分离。

种子培养基：葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，盐溶液 4 mL，蒸馏水100 mL；发酵培养基：改良种子培养基，根据实验加入相应的葡萄糖和蛋壳粉。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计 美国热电公司；真空干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司；恒温振荡摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；立式杀菌锅 上海三申医疗器械有限公司；多功能微生物自动测量仪 芬兰Growthcurves Ab公司；质构仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋壳粉的制备

新鲜蛋壳用蒸馏水冲洗，除去表面污垢以及膜上残留的蛋清液，1 mol/L NaCl溶液浸泡2 h后用蒸馏水冲洗，接着用100 mmol/L EDTA溶液，pH 8.5浸泡2 h，25 ℃烘干。将烘干后的蛋壳经粉碎机短时（10 s）粉碎，200 目筛分出蛋壳粉，与水按料液比1∶10（g/mL）、 600 r/min搅拌15 min，溶液经抽滤烘干得到蛋壳粉[18]。

1.3.2 菌株生长曲线的测定

取蒙氏肠球菌液100 μL于MRS肉汤培养基中活化24 h，将已活化的菌液按2%的接种量接种于内含100 mL种子培养基中，同时以种子培养基作为空白对照，37 ℃振荡培养，并于600 nm波长处使用多功能微生物自动测量仪测定其生长曲线。

1.3.3 细胞固定化方法

SA载体固定化：菌悬液与等体积SA溶液混合并搅拌5 min，SA质量浓度为20 g/L，将混合溶液置于无菌注射器（5 mL）中并使其逐滴滴入100 mL 20 g/L CaCl2溶液中，并将小球放在37 ℃硬化30 min，然后用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4 ℃保存备用[19]。

SA-PVA载体固定化：菌悬液与等体积含70 g/L PVA和10 g/L SA的溶液混合，并使用灭菌注射器（5 mL）将混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃贮存24 h后，用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4 ℃保存备用[20]。

SA-C载体固定化：菌悬液与等体积含10 g/L活性炭和30 g/L SA的溶液混合，并使用灭菌注射器（5 mL）将混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃贮存24 h后，用无菌蒸馏水洗涤以除去过量的钙离子和未包埋的细胞，4 ℃保存备用[21]。

1.3.4 不同载体固定化细胞的机械强度和传质性能测定

机械强度测定采用质构仪。参数设置：探头：P6；测试模式：TPA压缩模式；触发值：0.005 N；压缩比：75%；测前速率、测试速率、测后速率均设为1.0 mm/s；下压距离为10 mm，选取制备好的凝胶小球5～10 个进行测试，实验结果取平均值。

传质系数测定：参照任静[22]的方法并稍作改动，无菌条件下，在锥形瓶内装有100 mL 1 mg/mL的葡萄糖溶液，并随机取30 粒固定化小球浸泡，37 ℃浸泡24 h，并于540 nm波长处采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定浸泡前后锥形瓶中葡萄糖溶液OD值的变化，按式（1）计算固定化细胞的传质系数：

1.3.5 乳酸钙含量的测定

采用EDTA定钙法，离心取上清液1 mL，加蒸馏水50 mL，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，钙黄绿素指示剂20 mg，用0.05 mol/L EDTA-Na2溶液至背光观察黄绿色荧光变为橙色为止，并记录EDTA-Na2的体积。根据乳酸钙折换为乳酸的系数为1.711，通过乳酸含量测定乳酸钙[23]。

1.3.6 残糖含量的测定

采用DNS法测定发酵液中残留的葡萄糖含量。葡萄糖标准曲线：用7 支25 mL比色管，分别加1 mg/mL的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，蒸馏水补至2 mL，加入1.5 mL DNS试剂摇匀，沸水浴5 min，将冷却至室温。蒸馏水定容到25 mL，540 nm波长处测OD值。

1.3.7 发酵液中乳酸钙的提取与蛋壳粉转化率计算

菌种发酵完全后，将获得的发酵液进行过滤，以除去菌体和多余的蛋壳粉，将滤液加入氢氧化钙调节pH值至10左右，并加入1%的活性碳，于94 ℃除杂并脱色20 min。趁热用布氏漏斗加双层化学分析滤纸抽滤，收集滤液。将滤液放置于85 ℃浓缩至合适体积，冷却静置结晶24 h，分离晶体与母液，由于母液中还残留大量的乳酸钙，浓缩后再次结晶，晶体放置于70 ℃烘箱干燥至合适程度。蛋壳粉转化率按式（2）计算[24]：

1.3.8 不同包埋载体固定化小球的微观结构观察

将不同材料的固定化细胞置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定6 h，然后用无菌蒸馏水洗涤固定化细胞3 次，每次10 min，以去除戊二醛。洗涤后样品依次浸泡于30%、50%、70%和90%乙醇溶液中进行梯度脱水，每个梯度洗涤一次，每次10 min，最后用无水乙醇洗涤2 次，每次15 min，以移除最后的水分。将充分脱水后的样品于冷冻干燥仪中进行干燥，干燥后样品粘在具有双面胶带的样品台上固定、喷金，最后使用扫描电镜进行观察。

1.3.9 最适包埋载体分析

1.3.9.1 葡萄糖加入量对固定化细胞产乳酸钙的影响

发酵液采用种子培养基改良，蛋壳粉80 g/L，设置6 组实验葡萄糖加入量分别为80、100、120、140、160、180 g/L，并接种后于37 ℃、180 r/min摇床振荡培养72 h，研究葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响。

1.3.9.2 蛋壳粉加入量对固定化细胞机械强度的影响

发酵液采用种子培养基改良，葡萄糖120 g/L，设置5 组实验蛋壳粉加入量分别为0、40、60、80、100 g/L，研究蛋壳粉加入量对固定化细胞机械强度的影响，发酵条件同1.3.9.1节。

1.3.9.3 温度、pH值对乳酸钙产量的影响

设置温度为18、23、28、33、38、43 ℃，pH值为4.3、5.7、6.8、7.6、8.7，探究温度与pH值对乳酸钙产量的影响。

1.3.9.4 固定化细胞的贮存稳定性

将制备好的固定化小球保存于4 ℃的无菌生理盐水中，每隔9 d测定其发酵蛋壳粉生产乳酸钙产量。

1.4 数据分析

数据采用SPSS 23.0统计软件进行单因子方差分析，Duncan多重比较，各表中数值以f s表示，并使用Origin 2015软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 蒙氏肠球菌的生长曲线

图 1 蒙氏肠球菌的生长曲线和相应的pH值变化Fig. 1 Growth curve of E. mundtii and corresponding pH evolution curve

由图1可以看出，在2 h后，菌种开始进入对数生长期，相应的pH值也在急速下降，并在10 h左右达到稳定期，其OD600nm值与pH值趋于稳定。由于处于对数生长期的微生物代谢旺盛，生长速率最大，在实际生产中通常选择对数期的微生物作为种子，使微生物发酵的延迟期缩短，而用于固定化的微生物要求生长旺盛，因此，实验选择培养10～12 h的菌种进行固定化，以提高微生物的利用效率。

2.2 不同载体固定化细胞的机械强度和传质系数

表 1 不同载体固定化细胞的机械强度与传质系数的比较Table 1 Comparison of mechanical strength and mass transfer coefficient of cells immobilized on different carriers

由表1可知，3 种载体中SA载体固定化细胞的机械强度值最大，而SA-PVA载体固定化细胞的传质系数值最大。在实际生产中，固定化细胞机械强度较低时，其固定化颗粒内部交联结构的致密程度低，利于增加其内部传质，但易使被固定的细胞泄漏、凝胶球破碎，且固定之后经过洗涤会造成菌体损失，从而不利于其发酵并失去连续发酵的意义。而当机械强度较高时，凝胶过于紧密，会降低其传质性，不利于底物和产物的扩散，从而导致其发酵性能降低。因，固定化细胞的机械强度并不是越大（或小）对发酵就越有利[25-26]。在比较3 种载体固定细胞的机械强度及传质系数后，选择载体为SA-C为宜。

2.3 游离细胞与不同载体固定化细胞生产乳酸钙产量的比较

图 2 游离细胞与不同载体固定化细胞生产乳酸钙能力比较Fig. 2 Comparison of calcium lactate production by free cells and cells immobilized on different carriers

图2 显示，游离细胞与S A、S A-C 及S A-P VA 3 种载体固定化细胞随着发酵时间的延长，其乳酸钙产量显着增加（P＜0.05），并在72 h达到最大值，分别为（102.01f 2.56）、（96.33f 1.86）、（101.02f 1.83）、（76.09f 1.97）g/L，且SA-C载体的固定化细胞其乳酸钙产量比其他2 种载体的乳酸钙产量高，而与游离细胞相当。可能是因为活性炭具有大的表面积和低的传质阻力利于细胞生长[27]，而在SA-PVA载体固定化细胞中观察到低水平的乳酸钙产生，可能是因为PVA是一种高黏性物质，在交联过程中易于发生黏连现象，且PVA凝胶存在很大的水溶胀性，其机械强度低，在固定化过程中易发生细胞泄漏[28]，引起部分菌体损失，从而降低菌种发酵性能。

2.4 游离细胞与不同包埋载体固定化细胞的操作稳定性

图 3 不同载体的固定化细胞和游离细胞的重复分批发酵Fig. 3 Repeated usability of immobilized and free cells

为更好地确定包埋载体，对3 种载体固定化细胞及游离细胞进行重复发酵实验，结果如图3所示。仅在重复发酵9 次时，游离细胞中乳酸钙产量与初始值相比降低近半，而SA-PVA载体固定化细胞机械稳定性比较差，在发酵过程中有部分溶解，在重复使用12 次时已大部分溶解，不利于实际生产的使用。SA载体在重复使用18 次后，其乳酸钙产量仍保留在80%以上，而SA-C载体在重复使用10 次之后，其发酵周期缩短为48 h即可达到 第1次产乳酸钙的含量，并且由于发酵液中蛋壳粉的存在，可提供钙离子，避免了固定化小球出现机械强度差的问题，始终维持着良好的机械稳定性[29]。而SA-C载体显示出比其他2 种载体更好的固定化效果，可能是因为它是通过包埋和吸附相结合使用复合固定化方法制备，克服了单一固定化技术的缺点[30]，固定化细胞的有效再利用可能是由于其酶活性高于游离细胞[31]，具有更高的细胞操作稳定性。

2.5 不同载体固定化细胞的微观结构

图 4 固定化细胞的扫描电镜图Fig. 4 Scanning electron micrographs of immobilized cells

图4A显示，SA载体表面光滑，不利于其菌体细胞的附着；由图4B可以看到，SA-C载体的表面粗糙，为固定在其上的菌体细胞提供良好的附着微环境；由图4C可知，SA-PVA载体表面有许多空隙，具有较大的比表面积利于菌体细胞的附着。而观察图4D～F可知，SA、SA-C两种包埋载体内部均成功的附着有大量菌体细胞，且菌体细胞颗粒饱满，而SA-PVA包埋载体内部图发现出现了许多小孔，且没有发现菌体的附着，可能是由于PVA凝胶具有很大的水溶胀性，在处理品过程中导致其机械稳定性差使得部分菌体细胞脱落，从而未观察到；在重复发酵18 次后，由图4G、H可知，SA-C与SA载体固定化细胞内部相比聚集了更多的菌体细胞，且内部构造强度仍然很好，维持着高密度细胞发酵，有利于乳酸钙产量的提高，这可能是其在重复发酵10 次后有缩短发酵周期趋势的主要原因。因，最终选择SA-C载体作为固定化蒙氏肠球菌的最适包埋载体。

2.6 葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响

在确定SA-C作为最适包埋载体后，对发酵液中葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响进行探究，如图5所示，随发酵液中葡萄糖加入量增加，乳酸钙产量呈现先增加后降低的趋势，在葡萄糖加入量为120 g/L时乳酸钙产量最高，达（100.07f 2.58）g/L，且蛋壳粉转化率为82.43%。随着葡萄糖加入量的继续增加反而使乳酸钙产量降低，主要是由于发酵液中葡萄糖加入量过高时，对菌体的生长和产乳酸钙速率的抑制也会增强[32]。因，综合考虑选择发酵液中的葡萄糖加入量为120 g/L。

图 5 葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响Fig. 5 Effect of glucose concentration on calcium lactate production

2.7 蛋壳粉加入量对固定化细胞机械强度的影响

机械强度的稳定性对于固定化细胞在长期应用中具有重要意义，机械强度太高，会阻碍营养物质的传递，相反会导致细胞渗漏、凝胶破裂[33]。由表2可知，发酵液中加入不同量蛋壳粉对固定化细胞机械强度的影响具有显着差异（P＜0.05）。在发酵72 h后，没有加入蛋壳粉的固定化细胞机械强度明显降低，不利于实际应用，易造成凝胶破裂、细胞渗漏。而发酵液中加入蛋壳粉的固定化细胞，由于蛋壳粉的存在，其主要成分是碳酸钙，可为凝胶体系补充钙离子从而防止凝胶体系中的钙离子因被发酵液中磷酸盐等离子置换出来，而导致凝胶体系破裂的现象。结果说明蛋壳粉的存在有效维持了固定化细胞在长期发酵过程中的机械稳定性[29]。

表 2 蛋壳粉加入量对固定化细胞机械强度的影响Table 2 Effect of eggshell powder content on mechanical strength of immobilized cells

2.8 温度和pH值对乳酸钙产量的影响

图 6 温度（A）和pH值（B）对乳酸钙产量的影响Fig. 6 Effect of temperature (A) and pH (B) on calcium lactate production

如图6A所示，游离细胞与固定化细胞的最适温度相同，乳酸钙产量均在38 ℃时达到最大值，当温度过高或者过低时，均不利于乳酸钙的生成，而固定化细胞对不同温度的适应能力明显高于游离细胞。如图6B所示，在最适反应温度条件下，游离细胞与固定化细胞最适宜的pH值都为5.7，说明固定化以后没有改变蒙氏肠球菌生长适宜的pH值，而在pH值过低或过高时，固定化细胞生产乳酸钙的能力高于游离细胞，说明将细胞固定化之后提高了其pH值稳定性。

2.9 固定化细胞的贮存稳定性

将固定化细胞与游离细胞分别置于无菌生理盐水中，于冰箱中4 ℃保存。如图7所示，随着贮存时间的延长，固定化细胞的贮存稳定性明显高于游离细胞，且在4 ℃冷藏54 d后，乳酸钙产量与新制备的固定化细胞相比仅下降13.45 g/L，由说明固定化细胞具有良好的贮存稳定性。

图 7 游离细胞与固定化细胞的贮存稳定性Fig. 7 Storage stabilities of free and immobilized cells

3 结 论

本研究采用固定化细胞技术利用蛋壳废物生产乳酸钙，对固定化包埋载体进行探讨，并确定SA-C作为最适包埋载体，其产乳酸钙能力与游离细胞相当，在重复发酵18 次后仍维持高产率的乳酸钙。而发酵液中蛋壳废物的存在既维持了固定化细胞的机械稳定性，又与乳酸充分结合生成乳酸钙，有效提高了蛋壳废物的利用。与游离细胞相比，固定化细胞的操作稳定性、温度、pH值及贮存稳定性在一定范围内都有明显的提高，为利用固定化细胞技术生产蛋壳乳酸钙提供一定的理论支持，且所制得的凝胶球可满足连续化发酵生产工艺的要求。